| Summary: | SANTOS, Ana Angélica Queiroz Assunção. Estudo das alterações morfológicas induzidas pela Toxina A, do Clostridium difficile em células epiteliais intestinais e do efeito protetor da Glutamina e Alanil-glutamina. 2011. 120 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. === Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-12-06T13:02:50Z
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Previous issue date: 2011 === Clostridium difficile is the major cause of antibiotic-associated colitis, a disease with significant morbidity and mortality. Glutamine (Gln), a non-essential aminoacid, is a major fuel for the dynamic intestinal cell population. Alanyl-glutamine (Ala-Gln) is a dipeptide that is highly soluble and well tolerated. The aim of this study was to analyze the changes induced by Clostridium difficile toxin A (TcdA) in intestinal epithelial cell morphology and cytoskeletal element and the effect of Gln and Ala-Gln treatment, using advanced microscopic techniques. Twelve well cell culture plates, with 13 mm diameter glass coverlids, were seeded with 5x105 IEC-6 cells and grown for 24h in DMEM media. Afterwards, the wells were incubated for 24h as follow: control, TcdA (10 ng/mL), TcdA + Gln (10 mM) and TcdA + Ala-Gln (10 mM). The cells were than fixed in 4% formaldehyde for 14 h and afterwards they were examined by atomic force microscopy (AFM), scanning electronic microscopy (SEM) and Fluorescent microscopy. For the SEM the samples were fixed to samples holders with carbon adhesive tape and covered with a 15 mm gold film for conductivity by sputter. To fluorescent microscopy the cells were permeabilizided with PBS/Triton after that they were marked with stained with FITC-RhoA, Rodhamine-phallodin and DAPI performed using an inverted fluorescence microscope. An immunoblotting was realized with the same groups. The PVDF membrane was incubated with RhoA antibody overnight and afterwards activated by Amershan kit. The proteic control was made by α- tubulin. Also performed experiments of cellular proliferation and oxidative stress. As observed by AFM, SEM and Fluorescent microscopy TcdA caused intense cell shrinkage with multiple extensions. This change in shape was associated with collapse of the F-actin cytoskeleton demonstrated by fluorescent microscopy. An increase of RhoA production was detected in the groups treated with Gln e Ala-Gln. We demonstrated that TcdA dramatically altered the intestinal cell morphology and cytoskeleton organization and that Ala-Gln and Gln supplementation consistently prevented the intestinal epithelial cell damage induced by TcdA probably by increasing RhoA expression. The TcdA induced a reduction of 8.4% in cell proliferation while the Ala-Gln and Gln increased by 13.2% and 12.7%, respectively. The TcdA induced cells to oxidative damage, which was reversed by the use of Gln and Ala-Gln.. Our findings provide rationale for the potential use of Ala-Gln and Gln as adjuvant therapy in Clostridium difficile disease. Investigation of morphological and cytoskeleton changes using advanced microscopic techniques may aid in the evaluation of the protective or therapeutic activity of drugs against TcdA effects. === Clostridium difficile é a maior causa de colite associada ao uso de antibióticos, com significante morbidade e mortalidade. Glutamina (Gln), um aminoácido não-essencial, é a maior fonte combustível para a dinâmica das células intestinais. Alanil-glutamina (Ala-Gln) é um dipeptídeo, altamente solúvel e bem tolerado. O objetivo deste estudo foi analisar as alterações induzidas pela toxina A (TcdA) do Clostridium difficile na morfologia e elementos do citoesqueleto das células epiteliais intestinais e o efeito do tratamento com Gln e Ala-Gln, utilizando técnicas avançadas de microscopia. Placas de cultura de células com doze poços, previamente acrescidas de lamínulas de vidro, com diâmetro de 13mm, IEC-6, 5x105 foram semeadas e cultivadas por 24 horas em meio DMEM. Depois, as células foram incubadas por 24h de acordo com os seguintes grupos: Controle, TcdA (10 ng / mL), TcdA + Gln (10 mM) e TcdA + Ala-Gln (10 mM). As células foram fixados em formol a 4% por 14h, depois foram examinados na microscopia de força atômica (AFM), microscopia eletrônica de varredura (SEM), microscopia confocal e fluorescente. Para o SEM as amostras foram fixadas em porta amostras fita adesiva de carbono e cobertos com uma película de ouro 15 mm para adquirir condutividade por pulverização catódica. Para microscopia de fluorescência e o confocal, as células foram permeabilizadas com PBS/Triton depois foram marcados com RhoA- FITC, Faloidina –Rodamina e DAPI e as imagens capturadas através de um microscópio invertido de fluorescência ou confocal. Um immunoblotting foi realizado com os mesmos grupos. A membrana PVDF foi incubada com o anticorpo RhoA overnight, em seguida ativado pelo kit Amershan. O controle protéico foi feito por α-tubulina. Também realizarmos experimentos de proliferação celular e estresse oxidativo. Observou-se que a TcdA causa intenso encolhimento celular restando múltiplas extensões filamentosas. Esta alteração na forma foi associada ao colapso do citoesqueleto de F-actina demonstrada na microscopia de fluorescência. Um aumento da produção RhoA foi detectada no grupo tratado com Gln e Ala-Gln. Demonstramos que a morfologia das células intestinais e organização do citoesqueleto foram dramaticamente alteradas pela TcdA e que a suplementação com Ala-Gln e Gln impediu o dano celular epitelial intestinal induzida pela TcdA provavelmente por aumentar a expressão RhoA. A TcdA induziu uma redução de 8,4% na proliferação celular, enquanto o Ala-Gln e Gln aumentou 13,2% e 12,7%, respectivamente. A TcdA induziu as células ao dano oxidativo, que foi revertido com o uso de Gln e Ala-Gln. Nossos resultados fornecem justificativa para o uso potencial de Ala-Gln e Gln como terapia adjuvante na doença causada pelo Clostridium difficile. Investigação de alterações morfológicas e citoesqueleto usando avançadas técnicas de microscopia pode auxiliar na avaliação da atividade de proteção ou terapêutica de drogas contra os efeitos TcdA.
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