| Summary: | XIMENES, Rafael Matos. Atividade antifosfolipásica A2 da harpalicina 2, uma isoflavona isolada de Harpalyce brasiliana Benth. 2012. 134 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2012. === Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-11-01T16:05:00Z
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Previous issue date: 2012 === Secretory phospholipases A2 (sPLA2, EC 3.1.1.4) hydrolyses the sn-2 ester bond of phospholipids, releasing fatty acids and lysophospholipids. The expression of these enzymes is found to be elevated in many pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, sepsis, atherosclerosis, and cancer. Moreover, sPLA2s are the main toxic components of some snake venoms, being the mainly responsible for the local tissue damage. Harpalycin 2 is an isoflavona isolated from the leaves of Harpalyce brasiliana Benth., a snakeroot used in folk medicine to treat snake bites and inflammation in Northeast of Brazil. The aim of this study was evaluate the effect of harpalycin 2 in the enzymatic, edematogenic, and myotoxic activities of sPLA2s isolated from Bothrops pirajai (PrTX-III), Crotalus durissus terrificus (Cdt F15), Apis mellifera (Apis), and Naja naja (Naja) venoms. Futher, the effect on the platelet aggregation induced by PrTX-III as a result of the treatment with harpalycin 2 was also evaluated. Harpalycin 2 inhibited all sPLA2s tested, with inhibition percentages of 58.7, 78.8, 87.7, and 88.1 % for PrTX-III, Cdt F15, Apis, and Naja, respectively. The early phase of the edema induced by sPLA2s administration was also inhibited by harpalycin 2, as well as the myotoxicity. When assayed specifically with the PrTX-III, in comparison with two standard sPLA2 inhibitor, aristolochic acid (Aris Ac) and p-bromophenacyl bromide (p-BPB), the IC50 of harpalycin 2 on the enzymatic activity was 11.34 ± 0.28 μg/mL. Conformational changes as a slightly unfolding and the transition from the dimeric to the monomeric form were also observed after treatment with the harpalycin 2, with no changes in the molecular mass of the protein. In the platelet aggregation assays, the harpalycin 2 incubated with the PrTX-III inhibited the aggregation when compared to the untreated protein. The inhibitory effect of Aris Ac and p-BPB were lower than that of harpalycin 2, which also inhibited the aggregation induced by arachidonic acid. The docking results, using the crystallographic structures of the sPLA2s taken from the Protein Data Bank, showed a trend between the GOLD scores and the percentages of catalytic activity and platelet aggregation inhibition, showing the formation of hydrogen bonds between harpalycin 2 and important residues in the active site of the sPLA2s, as His48. In conclusion, these results showed the inhibitory effect of harpalycin 2 on the enzymatic and toxic activities of sPLA2s, corroborating, at least in part, the use of H. brasiliana in folk medicine. === As fosfolipases A2 secretórias (sPLA2, EC 3.1.1.4) hidrolisam a ligação éster sn-2 dos fosfolipídios, liberando ácidos graxos e lisofosfolipídios. A expressão destas enzimas esta elevada em diversas condições patológicas como, artrite reumatóide, sepse, aterosclerose e câncer. Além disto, as sPLA2s são os principais componentes tóxicos dos venenos de algumas serpentes, sendo os principais responsáveis pelo dano tecidual local. A harpalicina 2 é uma isoflavona isolada das folhas de Harpalyce brasiliana Benth., uma raiz-de-cobra utilizada na medicina popular do Nordeste para tratar envenenamentos por serpentes e condições inflamatórias. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da harpalicina 2 nas atividades enzimática, edematogênica e miotóxica de sPLA2s isoladas dos venenos de Bothrops pirajai (PrTX-III), Crotalus durissus terrificus (Cdt F15), Apis mellifera (Apis) e Naja naja (Naja). Além disso, o efeito sobre agregação plaquetária induzida pela piratoxina-III (PrTX-III) em decorrência do tratamento com a harpalicina 2 também foi avaliado. A harpalicina 2 inibiu todas as sPLA2s testadas, com percentuais de inibição de 58,7, 78,8, 87,7 e 88,1 % para PrTX-III, Cdt F15, Apis e Naja, respectivamente. A primeira fase da atividade edematogênica induzida pela administração das sPLA2s também foi inibida pela harpalicina 2, assim como a miotoxicidade. Quando avaliada especificamente sobre a PrTX-III, em comparação com os inibidores padrão, ácido aristolóchico (Aris Ac) e brometo de p-bromofenacila (p-BPB), a IC50 da harpalicina 2 sobre a atividade enzimática foi de 11,34 ± 0,28 μg/mL. Alterações conformacionais como um leve desenovelamento e a transição da forma dimérica para monomérica também foram observadas após o tratamento com a harpalicina 2, sem contudo alterar a massa da proteína. Nos experimentos de agregação plaquetária, a harpalicina 2 incubada previamente com a PrTX-III inibiu a agregação quando comparada a proteína não tratada. O efeito inibitório do ácido aristolóchico e do p-BPB foram menores do que os da harpalicina 2, que também inibiu a agregação induzida pelo ácido araquidônico. Os resultados de docking, obtidos utilizando as estruturas cristalográficas das sPLA2s oriundas do Protein Data Bank, revelaram uma tendência entre os valores dos GOLD scores e os percentuais de inibição da atividade enzimática e de agregação plaquetária, apontando a formação de ligações de hidrogênio entre a harpalicina 2 e resíduos importantes do sítio ativo das sPLA2s, como a histidina-48. Em conclusão, estes resultados mostraram o efeito inibitório da harpalicina 2 sobre as atividades enzimáticas e tóxicas das sPLA2s, corroborando, em parte, o uso da H. brasiliana na medicina popular.
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