| Summary: | FERNANDES, C. A depleção de células TREGS agrava a mucosite intestinal experimental induzida por irinotecano. 2017. 126 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, 2017. === Submitted by Farmacologia Pós-Graduação (posgfarmacologia@gmail.com) on 2017-11-10T17:00:35Z
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Previous issue date: 2017-09-13 === Intestinal mucositis (IM) is a common side effect related to anti-cancer chemotherapy based on irinotecan. MI is characterized by severe diarrhea and significantly affects patients' quality of life, increasing morbidity and health costs. Up to 80% of irinotecan-treated patients develop some degree of MI. The pathophysiology of this side effect is not fully understood and, unfortunately, there is no specific and effective treatment. The investigation of pathophysiological mechanisms may potentially guide the discovery of biomarkers or new therapeutic strategies. Previous studies point to the involvement of inflammatory molecules and cells, such as nitric oxide, COX-2, KC (analogous to human IL-8), TNF-α, IL-1, IL-18 and IL-33, toll-like receptors and neutrophils in the pathogenesis of MI in murine models. However, the participation of other innate and adaptive immune system cells, regulated in part by these cytokines, has not been investigated yet. Aim: To identify the expression profile of Tregs, Th7, Th (non-reg and non-Th17 cells) and type 3 innate lymphoid cells along the development of irinotecan-induced IM and to evaluate the role of Tregs in the pathogenesis. Methods: C57BL/6 (20-25g) received saline or irinotecan (75 mg/kg, i.p.), once daily/4 days, for induction of MI. Euthanasia occurred on days 1 (D1), D3, D5 or D7. For depletion of the Tregs the mice were pretreated with cyclophosphamide (100 mg/kg), 2h before the first dose of irinotecan, and euthanized on D7. Lymphocytes from intestinal lamina propria were isolated by enzymatic digestion and percoll gradient and splenic cells by mechanical digestion. The frequency of different lymphocyte subpopulations was identified by flow cytometry. On the day of euthanasia, a peripheral blood sample was collected for blood leukocyte count (x 103/l) and ileum samples for MPO, cytokine and histopathological assay. Results: The mice with MI had weight loss (P<0.05), leucopenia (P<0.05), diarrhea (P <0.05), intestinal damage (P<0.05) and reduction of villus/crypt ratio (P<0.05). In addition, irinotecan injection induced the increase of the % of Tregs (P<0.05) and % of Th17 cells (P<0.05), intestinal and splenic. The ratio of intestinal %Treg / Th17 correlated positively with severity parameters, such as diarrhea (P<0.05) and histopathological (P<0.05) scores of mice. There was a negative correlation between % Treg / Th17 splenic and these same parameters (P<0.05). Tregs depletion aggravated MI, increasing weight loss (P<0.05), diarrhea scores (P<0.05), mortality (100%) and reducing villus/crypt ratio (P<0, 05). The number of intestinal neutrophils increased after irinotecan injection, with the peak on D5 (P<0.05). In D7, there was a reduction in the number of these cells vs D5 (P<0.05). In addition, there was a negative correlation between the number of neutrophils and the % of Tregs (P<0.05). The frequency of type 3 innate lymphoid cells (P<0.05) and other Th cells, non-Treg and non-Th17 cells (P<0.05), decreased after irinotecan injection and were positively modulated after Tregs depletion. In addition, irinotecan injection elevated TNF-, IL-1, KC and IL-17A cytokines in the gut (P<0.05). With Tregs depletion, the levels of KC (P <0.05) and TNF- (P<0.05) were potentialized, and there was a reduction of IL-10 (P<0.05). Conclusion: Tregs cells are important to counterbalancing inflammation in irinotecan induced-IM. === A mucosite intestinal (MI) é um efeito colateral comum relacionado à quimioterapia anti-câncer baseada em irinotecano. MI cursa com diarreia intensa e afeta de forma significativa a qualidade de vida dos pacientes, aumentando a morbidade e os custos com a saúde. Cerca de até 80% dos pacientes tratados com irinotecano desenvolvem algum grau de MI. A fisiopatologia deste efeito colateral não está completamente esclarecida e, infelizmente, não há um tratamento específico e efetivo. A investigação de mecanismos fisiopatológicos pode potencialmente guiar a descoberta de biomarcadores ou novas estratégias terapêuticas. Estudos anteriores apontam para o envolvimento de moléculas e células inflamatórias, tais como: óxido nítrico, COX-2, KC (análoga à IL-8 humana), TNF-α, IL1-, IL-18 e IL-33, receptores semelhantes a toll e neutrófilos na patogênese da MI em modelos murinos. Entretanto, a participação de outras células do sistema imune inato e adaptativo, reguladas em parte por estas citocinas, ainda não foi investigada. Objetivo: Traçar o perfil de expressão das células Tregs, Th7, Th (não-reg e não-Th17) e linfoides inatas do tipo 3 ao longo do desenvolvimento da MI induzida por irinotecano e avaliar o papel das Tregs na patogênese. Métodos: C57BL/6 (20-25g) receberam salina ou irinotecano (75 mg/kg, i.p.), uma vez ao dia/4 dias, para indução da MI. A eutanásia ocorreu nos dias 1(D1), D3, D5 ou D7. Para depleção das Tregs os animais foram pré-tratados com ciclofosfamida (100mg/kg), 2h antes da primeira dose de irinotecano e eutanasiados no D7. Os linfócitos da lâmina própria foram isolados por digestão enzimática e gradiente de percoll e as células esplênicas por digestão mecânica. A frequência das diferentes subpopulações linfocitárias foi identificada por citometria de fluxo. No dia da eutanásia coletou-se amostra de sangue periférico para contagem de leucócitos sangúíneos (x103/l) e amostras de íleo para ensaio de MPO, dosagem de citocinas e histopatológico. Resultados: A MI cursou com perda ponderal (P<0,05), leucopenia (P<0,05), diarreia (P<0,05), lesão intestinal (P<0,05) e redução da razão vilo/cripta (P<0,05). Adicionalmente, a injeção de irinotecano induziu o aumento do %Tregs (P<0,05) e %Th17 (P<0,05), intestinais e esplênicas. A razão entre % Treg/Th17 intestinal correlacionou-se positivamente com parâmetros de gravidade, como os escores de diarreia (P<0,05) e histopatológicos (P<0,05) dos animais. Houve uma correlação negativa entre %Treg/Th17 esplênico e esses mesmos parâmetros (P<0,05). A depleção de Tregs agravou a MI, aumentando a perda ponderal (P<0,05), os escores de diarreia (P<0,05), a mortalidade (100%) e reduzindo a razão vilo/cripta (P<0,05). O número de neutrófilos intestinais aumentou após injeção de irinotecano, com pico no D5 (P<0,05). No D7, houve uma redução no número dessas células vs D5 (P<0,05). Além disso, houve uma correlação negativa entre o número de neutrófilos e o %Tregs (P<0,05). A frequência de células linfoides inatas do tipo 3 (P<0,05) e de outras células Th, não-Treg e não-Th17 (P<0,05), diminuiu após a injeção de irinotecano, sendo moduladas positivamente após a depleção de Tregs. Além disso, a injeção de irinotecano elevou as citocinas TNF-, IL-1, KC e IL-17A no intestino dos animais (P<0,05). Com a depleção das Tregs, os níveis de KC (P<0,05) e TNF-P<0,05) foram potencializados, além de ocorrer uma redução de IL-10 (P<0,05). Conclusão: As células Tregs são importantes para contrabalancear a inflamação na MI induzida por irinotecano.
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