Piericidina A1 de Streptomyces SP. recuperada de sedimento do arquipélago Fernando de Noronha altera fenótipo de células tumorais

• Main Author: Florêncio, Katharine Gurgel Dias
• Other Authors: Wilke , Diego Veras
• Language: Portuguese
• Published: 2017
• Subjects: Farmacologia; Produtos Biológicos; Citotoxicidade Imunológica
• Online Access: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/22015

FLORÊNCIO, K. G. D. Piericidina A1 de Streptomyces SP. recuperada de sedimento do arquipélago Fernando de Noronha altera fenótipo de células tumorais. 2017. 100 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. === Submitted by Erika Fernandes ([e-mail]) on 2017-02-14T15:52:00Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_kgdflorencio.pdf: 2180779 bytes, checksum: 81aa72b2692c21ed2525d3bbcdec95ec (MD5) === Approved for entry into archive by Erika Fernandes ([e-mail]) on 2017-02-14T15:52:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_kgdflorencio.pdf: 2180779 bytes, checksum: 81aa72b2692c21ed2525d3bbcdec95ec (MD5) === Made available in DSpace on 2017-02-14T15:52:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_kgdflorencio.pdf: 2180779 bytes, checksum: 81aa72b2692c21ed2525d3bbcdec95ec (MD5) Previous issue date: 2017-01-30 === Cancer is a major health problem and presents great biological complexity, making it extremely difficult to develop effective therapeutic strategies to treatment of the disease, especially in advanced stages. Natural products play an important role in pharmacology because of the notorious contribution to the development of drugs as pharmacological tools. The marine sediment is a profitable source of microorganisms that produce secondary metabolites with biomedical properties, and the actinomycetes, Gram-positive bacteria, are excellent producers of compounds with diverse biological activities. In this work, the pharmacological potential of the microbiota recovered from the marine sediment collected in Fernando de Noronha Archipelago was investigated in tumor cells in culture. Sixteen actinomycete lineages were isolated, 7 of which yielded cytotoxic crude extracts (inhibition of growth > 75%) in human colorectal cancer cells HCT-116. The mean inhibitory concentration (IC50) values of the crude extracts varied from 0.06 to 10g/mL. The BRA-399 strain, identified as Streptomyces sp., presented the highest potency (IC50 = 0.06g/mL) and was selected to proceed with the purification of the active principle and characterization of the biological effect in tumor cells. Through a bioguided chemical fractionation, Piericidin A1 (PA1) was isolated, and other molecules of the same class were identified. The cytotoxicity of PA1 was then investigated in 2 tumoral lineages, HCT-116 and in murine metastatic melanoma (B16-F10). The MTT, SRB, cell count and membrane integrity by cytometry assays were performed with both cell lines to obtain a cell proliferation inhibition profile caused by PA1 at 24, 48 and 72h. The results showed cell proliferation inhibition in both lineages at the highest tested concentrations (between 3.8nM and 12M). Lower concentrations (0.1 to 24pM) inhibited proliferation in HCT-116 cells, but not in B16-F10 cells. Despite the unique potency, cells had the membrane integrity preserved at almost all concentrations, except the greater, 12M. PA1 blocks the complex I of the electron transport chain, and the change in the energy metabolism is a hallmark of tumor cells involved in tumor agressiveness. From these observations, some experiments were carried out to evaluate the influence of PA1 on the agressiveness of tumor cells (HCT-116 and B16-F10) in the concentration of 500fM. Cells pretreated with PA1 showed an increase in IC50 compared to treatment with the chemotherapeutic doxorubicin. Treatment with PA1 also increased the cell migration rate in B16-F10, as well as induced morphological alterations compatible with greater migratory activity cells, reinforcing the hypothesis that the alteration caused by PA1 in the tumor cell metabolism may induce alteration in their phenotype. === O câncer é um grande problema de saúde e apresenta grande complexidade biológica, tornando extremamente difícil o desenvolvimento de estratégias terapêuticas eficazes para tratamento da doença sobretudo em estados avançados. Os produtos naturais desempenham um papel relevante na farmacologia pela notória contribuição para desenvolvimento de fármacos como de ferramentas farmacológicas. O sedimento marinho é uma fonte profícua de microrganismos produtores de metabólitos secundários com propriedades biomédicas e os actinomicetos, bactérias Gram-positivas, são excelentes produtores de compostos com diversas atividades biológicas. Neste trabalho, o potencial farmacológico da microbiota recuperada do sedimento marinho coletado no Arquipélago Fernando de Noronha foi investigado em células tumorais em cultura. Dezesseis linhagens de actinomicetos foram isoladas, sendo que 7 renderam extratos brutos (EB) citotóxicos (inibição do crescimento > 75%) em células de câncer colorretal humano HCT-116. Os valores de concentração inibitória média (CI50) dos EBs variaram de 0,06 a 10 µg/mL. A linhagem BRA-399, identificada como Streptomyces sp., apresentou a maior potência (CI50 = 0,06 µg/mL) e foi selecionada para prosseguir com a purificação do princípio ativo e caracterização do efeito biológico em células tumorais. Através de um fracionamento químico bioguiado com diferentes polaridades, isolou-se a Piericidina A1 (PA1), e outras moléculas da mesma classe foram identificadas. A citotoxicidade da PA1 foi então investigada em 2 linhagens tumorais, HCT-116 e em melanoma metastático murino (B16-F10). Os ensaios do MTT, do SRB e de contagem de células e integridade de membrana por citometria foram realizados com ambas linhagens celulares para se obter um perfil de inibição da proliferação celular causado pela PA1 após 24, 48 e 72h. Os resultados mostraram inibição da proliferação celular em ambas linhagens nas concentrações mais altas testadas (entre 3,8 nM e 12 µM). Nas concentrações mais baixas (entre 0,1 aM e 24 pM) houve inibição da proliferação na linhagem HCT-116, mas não em B16-F10. Apesar da potência singular, as células tinham a integridade da membrana preservada em quase todas as concentrações, exceto a maior de 12 µM. A PA1 é um bloqueador do complexo I da cadeia transportadora de elétrons e a alteração do metabolismo energético é uma característica das células tumorais envolvida com a agressividade do tumor. A partir destas observações alguns experimentos foram realizados para avaliar a influência da PA1 na indução de alterações fenotípicas associadas à agressividade nas duas linhagens tumorais utilizadas (HCT-116 e B16-F10) na concentração de 500 fM. As células pré-tratadas com PA1 apresentaram aumento da CI50 frente ao tratamento com o quimioterápico doxorrubicina. O tratamento com PA1 também aumentou a taxa de migração celular em B16-F10, bem como induziu alterações morfológicas compatíveis com células com maior atividade migratória, reforçando a hipótese de que a alteração causada pela PA1 no metabolismo da célula tumoral pode induzir alteração no fenótipo destas.