Análise histológica de tecidos cultivados in vitro de plantas laticíferas, perfil de proteínas solúveis e ação contra fitopatógenos

• Main Author: Silva, Rayanne Farias da
• Other Authors: Ramos, Márcio Viana
• Language: Portuguese
• Published: 2016
• Subjects: Bioquímica; Calotropis procera; Cryptostegia grandiflora; Cultura de tecidos; Látex; Proteínas de defesa
• Online Access: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/19403

SILVA, Rayanne Farias da. Análise histológica de tecidos cultivados in vitro de plantas laticíferas, perfil de proteínas solúveis e ação contra fitopatógenos. 2015. 121 f. Dissertação (Mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. === Submitted by Elineudson Ribeiro ([e-mail]) on 2016-09-01T21:33:34Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_rfsilva.pdf: 3566752 bytes, checksum: 60c280c36514d085ed22317cb38b6cb5 (MD5) === Approved for entry into archive by Jairo Viana ([e-mail]) on 2016-09-02T21:01:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_rfsilva.pdf: 3566752 bytes, checksum: 60c280c36514d085ed22317cb38b6cb5 (MD5) === Made available in DSpace on 2016-09-02T21:01:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_rfsilva.pdf: 3566752 bytes, checksum: 60c280c36514d085ed22317cb38b6cb5 (MD5) Previous issue date: 2015 === Laticifers plants have been studied by presenting a wide range of proteins related to plant defense in its latex. The aim of this study was to investigate, in tissue cultured in vitro, proteins and activities described for latex laticíferas two species. Tissue callus and roots of Cryptostegia grandiflora were obtained by in vitro tissues culture protocols and subjected to histological analysis for laticifers characterization. Cultured tissue of Calotropis procera were used as comparative reference in the analysis. There wasn’t any laticifer structure in callus or roots of C. grandiflora while in C. procera laticifers are formed in the roots. Soluble proteins were extracted from the cultured tissue and characterized using enzymatic assays, biochemical, immunological techniques and mass spectrometry. The presence of activity against phytopathogenic fungi was investigated and all data obtained were compared with the previously one determined for the plants studied latex. Callus and roots proteins of C. procera showed antifungal activity against pathogenic fungi. The percentage inhibition of the vegetative hyphae growth in the presence of callus and roots C. procera protein respectively were 75.5% and 82.6% for Fusarium solani, 76.7% and 57.1% for Rhizoctonia solani, 88.8% and 79.8% for Fusarium oxysporum, 93.7% and 90.2% for Colletotrichum lindemuthianum and 80.2% and 79.7% for Colletotrichum gloesporioides, however, showed no effect on Mucor sp. Callus and roots proteins of C. grandiflora showed no inhibitory effect on the hyphae growth or spores germination of assayed fungi. Through assays using fluorescent markers, it was demonstrated that proteins extracted from in vitro culture of C. procera interact with the membrane of C. gloesporioides causing leakage of cytoplasmic contents, possibly suggesting that its mechanism of action against fungi is related to the change in plasma membrane permeability. Also oxidative stress was observed in C. gloesporioides spores treated with callus and roots protein C. procera by hydrogen peroxide production. Protease inhibitors, chitinases, osmotins and proteases were detected in the C. procera callus and roots samples, however, osmotins and proteases were not observed in C. grandiflora callus and roots. The activity of antioxidant enzymes APX, G-POD and catalase were observed in tissue cultured in vitro of C. grandiflora. Considering that C. grandiflora laticifers proteases were demonstrated exert action against fungi, the results observed in this study suggest that the absence of antifungal activity in C. grandiflora cultured tissue is due to the absence of proteases in these tissues as well exclude chitinases and proteases inhibitors as antifungal proteins. The study concludes that the use of cultured tissues that do not differentiate laticifers is an interesting model to study activities associated to proteins founded in latex. Antifungal proteases present in C. grandiflora latex were not found in the tissues without laticifer formation. === Plantas laticíferas têm sido estudadas por apresentarem uma grande diversidade de proteínas relacionadas à defesa vegetal em seu látex. O objetivo deste trabalho foi pesquisar em tecidos cultivados in vitro, proteínas e atividades descritas para o látex de duas espécies laticíferas. Tecidos de calos e raízes de Cryptostegia grandiflora foram obtidos através de protocolos de cultura in vitro de tecidos e submetidos à análise histológica para caracterização de laticíferos. Tecidos cultivados de Calotropis procera foram utilizados como referencial comparativo nas análises. Não foi detectada qualquer estrutura laticífera em calos ou raízes de C. grandiflora enquanto que em C. procera laticíferos se formam nas raízes. Proteínas solúveis foram extraídas dos tecidos cultivados e caracterizadas por meio de ensaios enzimáticos, técnicas bioquímicas, imunológicas e espectrometria de massas. A presença de atividade contra fungos fitopatogênicos foi investigada e todos os dados obtidos foram comparados com dados previamente determinados para os látex das espécies estudadas. Proteínas dos calos e raízes de C. procera, apresentaram atividade antifúngica sobre fungos fitopatogênicos. Os percentuais de inibição do crescimento vegetativo de hifas na presença de proteínas de calos e raízes de C. procera, respectivamente, foram: 75,5% e 82,6% para Fusarium solani, 76,7% e 57,1% para Rhizoctonia solani, 88,8% e 79,8% para Fusarium oxysporum, 93,7% e 90,2% para Colletotrichum lindemuthianum e 80,2% e 79,7% para Colletotrichum gloesporioides, no entanto, não demonstraram nenhum efeito sobre Mucor sp. As proteínas de calos e raízes de C. grandiflora não apresentaram qualquer efeito inibitório sobre o crescimento de hifas ou germinação de esporos dos fungos avaliados. Por meio de ensaios com marcadores de fluorescência, foi possível demonstrar que as proteínas extraídas da cultura in vitro de C. procera interagem com a membrana de C. gloesporioides causando extravasamento do conteúdo citoplasmático, sugerindo que possivelmente seu mecanismo de ação contra fungos esteja relacionado à alteração na permeabilidade da membrana plasmática. Também foi observado estresse oxidativo em esporos de C. gloesporioides tratados com proteínas de calos e raízes de C. procera através da produção de peróxido de hidrogênio. Inibidores de proteases, quitinases, osmotinas e proteases foram detectados nas amostras de calos e raízes de C. procera, porém, osmotinas e proteases não foram observadas em calos e raízes de C. grandiflora. A atividade das enzimas antioxidantes APX, G-POD e catalase foram observadas nos tecidos cultivados in vitro de C. grandiflora. Considerando que proteases laticíferas de C. grandiflora foram demonstradas exercer ação contra fungos, os resultados observados nesta pesquisa sugerem que a ausência de atividade antifúngica em tecidos cultivados de C. grandiflora deve-se a ausência de proteases nestes tecidos e ainda excluem quitinases e inibidores de proteases presentes como proteínas antifúngicas. Em calos e raízes de C. procera, além de proteases, outras proteínas tais como, quitinases, inibidores de proteases e osmotinas detectadas podem estar envolvidas na atividade antifúngica observada, e/ou agir sinergicamente na defesa contra fungos. O estudo conclui que o uso de tecidos cultivados que não diferenciam laticíferos é um interessante modelo para estudar atividades associadas às proteínas encontradas no látex. Proteases antifúngicas presentes no látex de C. grandiflora não foram encontradas nos tecidos sem formação laticífera.