| Summary: | CANUTO, J. A. Efeitos da Violaceína sobre as formas evolutivas de Trypanosoma cruzi. 2016. 78 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. === Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-06-13T12:12:37Z
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Previous issue date: 2016-02-19 === The World Health Organization estimates that about 7 to 8 million people are infected with Trypanosoma cruzi in the world. Treatment of Chagas disease has limited efficacy and side effects that limit tolerability and patient compliance. The search for new therapeutic alternatives from bioactive substances has grown significantly in recent years. Violacein (VIO), a bacterial pigment produced by Chromobacterium violaceum has shown several biological actions, among them, antiulcer action, antitumor, antiviral, and antiparasitic. In this paper, we studied the effects of VIO on the evolutionary forms of Trypanosoma cruzi. Epimastigotes were cultured in LIT at 28 ° C in the presence of VIO (0.97; 1.9; 3.9; 7.8; 15.62; 31.25; 62.5; 125; 250 ; 500; 1000μM) for 24, 48 and 72 hours. The trypomastigotes were obtained after infection in LLC-MK2 cells resuspended in DMEM 2% FBS and incubated with VIO (0.97; 1.9; 3.9; 7.8; 15.62; 31,25μM ) for 24h. amastigotes were cultivated on circular coverslips within culture plates containing LLC-MK2 cells and treated with violacein (4.97 and 9.94 mM). Cytotoxicity on LLC-MK2 mammalian cells was assessed using the MTT reduction assay, after incubation with VIO (3.9; 7.8; 15.62; 31.25; 62.5; 125; 250; 500μM ) for 24h. The evaluation of the process of cell death was made from the marking epimastigotes with 7AAD and Annexin V-PE after treatment with VIO (51.39 and 102,78μM). To determine the production of reactive oxygen species, epimastigotes were incubated with VIO (51.39 and 102,78μM). In determining the effect on the mitochondrial membrane potential, it was used Rhodamine 123 marker in epimastigotes treated with VIO (102,78μM). In epimastigotes, the substance showed trypanocidal action, with IC50 value of 51.39; 104.7 67,78μM and 24, 48 and 72h of treatment, respectively. In trypomastigotes, the IC 50 was 4,97μM in 24 hours. The analysis of amastigotes reduced the percentage of infected cells and the survival rate of these, at 24 and 48 hours at concentrations of 4.97 and 9.94 uM. In determining the cytotoxic effect on LLC-MK2, there was obtained an IC50 of 47,91μM. The analysis of the mechanisms of cell death allowed to infer that the VIO cause death in parasites predominantly by apoptosis. It was observed the production of reactive oxygen species (ROS), which can contribute to the aforementioned type of death. It was also observed a reduction in the mitochondrial membrane potential in the treated groups. All experiments were performed in triplicate (n = 3). For comparison of the experimental groups, the ANOVA was used, with post-test Dunnett, using p <0.05 as significance criterion. Thus, VIO presented trypanocidal effects on all of the evolutionary cycle of the parasite forms, suggesting involvement of reactive oxygen species and changes in mitochondrial membrane potential in the process of cell death by apoptosis. === A Organização Mundial de Saúde estima que aproximadamente 7 a 8 milhões de pessoas encontram-se infectadas pelo Trypanosoma cruzi no mundo. O tratamento da doença de Chagas apresenta eficácia limitada e efeitos colaterais que limitam a tolerabilidade e a adesão dos pacientes. A busca de novas alternativas terapêuticas a partir de substâncias bioativas cresceu bastante nos últimos anos. A violaceína (VIO), um pigmento bacteriano produzido por Chromobacterium violaceum tem mostrado diversas ações biológicas, dentre elas, ações antiulcerogênica, antitumoral, antiviral e antiparasitária. No presente trabalho, estudamos os efeitos da VIO sobre as formas evolutivas do Trypanosoma cruzi. As formas epimastigotas foram cultivadas em meio LIT, a 28°C, na presença de VIO (0,97; 1,9; 3,9; 7,8; 15,62; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000μM) por 24, 48 e 72h. As formas tripomastigotas, foram obtidas após infecção em células LLC-MK2, ressuspensas em meio DMEM 2% de SBF e incubadas com VIO (0,97; 1,9; 3,9; 7,8; 15,62; 31,25μM) por 24h. Formas amastigotas foram cultivadas em lamínulas circulares no interior de placas de cultura contendo células LLC-MK2 e tratadas com violaceína (4,97 e 9,94 μM). A citotoxicidade sobre células de mamíferos LLC-MK2 foi avaliada por meio do ensaio de redução do MTT, após incubação com VIO (3,9; 7,8; 15,62; 31,25; 62,5; 125; 250; 500μM) por 24h. A avaliação do processo de morte celular foi feita a partir da marcação de formas epimastigotas com 7AAD e Anexina V-PE após tratamento com VIO (51,39 e 102,78μM). Para a determinação da produção de espécies reativas de oxigênio, formas epimastigotas foram incubadas com VIO (51,39 e 102,78μM). Na determinação do efeito sobre o potencial de membrana mitocondrial, foi utilizado o marcador Rodamina 123 em formas epimastigotas tratadas com VIO (102,78μM). Em formas epimastigotas, a substância demonstrou ação tripanocida, com valor de CI50 igual a 51,39; 104,7 e 67,78μM em 24, 48 e 72h de tratamento, respectivamente. Em formas tripomastigotas, a CI50 foi de 4,97μM em 24h. A análise sobre formas amastigotas reduziu o percentual de células infectadas e o índice de sobrevivência destes, nos tempos de 24 e 48h, nas concentrações de 4,97 e 9,94 μM. Na determinação do efeito citotóxico sobre LLC-MK2, obteve-se uma CI50 de 47,91μM. A análise dos mecanismos de morte celular permitiu inferir que a VIO causa morte nos parasitos predominantemente por apoptose. Foi observado a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), que podem contribuir para o tipo de morte supracitado. Foi ainda observada a redução do potencial de membrana mitocondrial nos grupos tratados. Todos os experimentos foram realizados em triplicata (n=3). Para comparação dos grupos experimentais, foi utilizado o teste estatístico ANOVA, com pós-teste de Dunnet, utilizando p<0,05 como critério de significância. Dessa forma, a VIO apresentou efeitos tripanocida em todas as formas do ciclo evolutivo do parasito, sugerindo envolvimento de espécies reativas de oxigênio e alterações no potencial de membrana mitocondrial no processo de morte celular por apoptose.
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