Aspectos estruturais, farmacológicos e toxicológicos de Mo-CBP4, uma proteína ligante à quitina de Moringa oleifera com atividade anti-inflamatória e antinociceptiva via oral

• Main Author: Pereira, Mirella Leite
• Other Authors: Vasconcelos, Ilka Maria
• Language: Portuguese
• Published: 2016
• Subjects: Biotecnologia farmacêutica; Lectinas; Fitoquímicos; Moringa oleifera
• Online Access: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/14962

PEREIRA, M. L. Aspectos estruturais, farmacológicos e toxicológicos de Mo-CBP4, uma proteína ligante à quitina de Moringa oleifera com atividade anti-inflamatória e antinociceptiva via oral. 2014. 211 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. === Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva ([e-mail]) on 2015-01-22T17:51:51Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_mlpereira.pdf: 5385701 bytes, checksum: bf5a77dbe6d55bd0fb09e766abc43303 (MD5) === Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa([e-mail]) on 2016-01-26T22:44:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_mlpereira.pdf: 5385701 bytes, checksum: bf5a77dbe6d55bd0fb09e766abc43303 (MD5) === Made available in DSpace on 2016-01-26T22:44:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_mlpereira.pdf: 5385701 bytes, checksum: bf5a77dbe6d55bd0fb09e766abc43303 (MD5) Previous issue date: 2014 === Mo-CBP4 is a chitin-binding protein that is associated with the antinociceptive and anti-inflammatory effects of Moringa oleifera seeds, a tree known for its medicinal value. The aim of this study was the structural, pharmacological and toxicological characterization of Mo-CBP4, focusing on its use as a therapeutic agent. Mo-CBP4 is a 11.8 kDa heterodimer, composed by 3.9 kDa and 8.4 kDa chains. Mo-CBP4 sequencing by Edman degradation and mass spectrometry showed the presence of many basic amino acid residues and high similarity with other proteins from M. oleifera seeds. Circular dichroism spectroscopy showed that the Mo-CBP4 contains 36% α-helix, 15% β-sheet, 19% turn and 30% unordered and high structural stability to temperature and pH variations. Mo-CBP4 (0.1, 1.0 and 10 mg/kg) by intravenous administration showed anti-inflammatory activity on the model of carrageenan-induced peritonitis in rats, with inhibition (79%) of neutrophil migration already at the lowest dose. Mo-CBP4 (40 mg/kg), when administered by oral route on mice, using the same mentioned model, also presented anti-inflammatory activity, causing a significant inhibition (48%) of neutrophil migration. Mo-CBP4 retained this activity even after heating at 100 °C or pre-incubation with 0.1 M N-acetyl-D-glucosamine, both for 1 hour. Serum levels of IL-1β and IL-10 after peritonitis induction changed in Mo-CBP4-pretreated mice. In addition, Mo-CBP4 (10 mg/kg), administered intraperitoneally, also showed antinociceptive activity by using the formalin (2.5%) test in mice model, inhibiting just the peripheral pain. In the carrageenan-induced mechanical hypernociception model, animals pretreated with oral Mo-CBP4 (20, 40 and 80 mg/kg), 1 hour prior to inflammatory agent use, proved to be more resistant to sensitization after 1, 3 and 5 hours, with maximal inhibition at a dose of 40 mg/kg, being this activity correlated with the reduction of neutrophil migration. Direct hypernociception caused by epinephrine or PGE2 was not affected with Mo-CBP4 pretreatment. Mo-CBP4 did not impair the locomotor activity of animals in the open field test. In general, no toxic signs or adverse effects were seen after oral administration of Mo-CBP4 at a single dose (2000 mg/kg) or after repeated doses (10, 40 and 100 mg/kg). Similarly, cytotoxicity and genotoxicity tests with Mo-CBP4, using tumour or normal cells, showed no toxicity. The results suggest that due to anti-inflammatory and antinociceptive properties, high stability and apparent lack of toxicity, Mo-CBP4 has great potential as a future biopharmaceutical drug. === Mo-CBP4 é uma proteína ligante à quitina, com atividade anti-inflamatória e antinociceptiva, isolada de sementes de Moringa oleifera Lamarck, uma árvore conhecida pelo seu valor medicinal. Este trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural, farmacológica e toxicológica de Mo-CBP4, com foco na sua utilização como agente terapêutico. Mo-CBP4 é um heterodímero de 11,8 kDa, composto por cadeias de 3,9 kDa e 8,4 kDa. O sequenciamento de Mo-CBP4 por degradação de Edman e espectrometria de massas mostrou a presença de muitos resíduos de aminoácidos básicos e alta similaridade com proteínas isoladas de sementes de M. oleifera. Análises espectroscópicas utilizando dicroísmo circular demonstraram que Mo-CBP4 é composta por α-hélices (36%), folhas-β (15%), voltas (19%) e estruturas ao acaso (30%), com alta estabilidade estrutural frente a variações de temperatura e pH. Mo-CBP4 (0,1, 1,0 e 10 mg/kg), por via endovenosa, mostrou atividade anti-inflamatória no modelo de peritonite induzida por carragenina em ratos, com inibição (79%) da migração de neutrófilos já na menor dose. Atividade anti-inflamatória de Mo-CBP4 (40 mg/kg) também ocorreu por via oral em camundongos, usando o mesmo modelo citado, com significativa inibição (48%) da migração de neutrófilos. Tal atividade permaneceu mesmo após aquecimento da proteína a 100 °C por 1 hora, porém, a pré-incubação com N-acetil-D-glucosamina 0,1 M foi capaz de reverter sua ação. Os níveis séricos de IL-1β e IL-10, após indução de peritonite, sofreram alteração com o pré-tratamento da proteína. Adicionalmente, Mo-CBP4 (10 mg/kg) mostrou atividade antinociceptiva, verificada através do teste da formalina (2,5%), quando administrada via intraperitoneal, inibindo apenas a dor periférica. No modelo de hipernocicepção mecânica induzida por carragenina, animais tratados via oral com a proteína (20, 40 e 80 mg/kg), 1 hora antes do agente inflamatório, mostraram-se mais resistentes à sensibilização após 1, 3 e 5 horas, apresentando inibição máxima na dose de 40 mg/kg, estando essa atividade relacionada com a redução da migração de neutrófilos. A hipernocicepção direta causada por PGE2 ou epinefrina não sofreu alteração com o pré-tratamento de Mo-CBP4. A proteína também não causou comprometimento na atividade locomotora dos animais, quando submetidos ao teste do campo aberto. A administração oral de Mo-CBP4 em dose única (2000 mg/kg) ou em doses repetidas (10, 40 e 100 mg/kg) não resultou em efeitos tóxicos ou adversos. Similarmente, avaliação da citotoxicidade e genotoxicidade de Mo-CBP4, utilizando células tumorais ou normais, mostrou ausência de toxicidade. Os resultados obtidos sugerem que devido às propriedades anti-inflamatória e antinociceptiva, alta estabilidade e aparente ausência de toxicidade, Mo-CBP4 possui grande potencial como um futuro biofármaco.