| Summary: | PEREIRA, Ticiana Praciano. Efeito tripanocida da L-amino ácido oxidaseisolada do veneno da Bothrops marajoensis. 2015. 84 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. === Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-10-19T13:13:10Z
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Previous issue date: 2015 === Trypanosoma cruzi,
the etiologic agent of Chagas disease, remains a p
ublic health problem in
the Americas. In the present study, we evaluated th
e effects of L-amino acid oxidase from
Bothrops marajoensis
venom (BmLAAO) on the all evolutive forms of
T. cruzi
. Epimastigote
forms of
T. cruzi
, were cultived in LIT medium, at 28ºC in BmLAAO pr
esence for 48 and
72h. Trypomastigote were obtained from the supernat
ants of infected LLC-MK
2
cells,
resuspended in MEM with 2% FBS and treated for 24 h
. BmLAAO showed significant
activity against the epimastigote (IC
50
48h = 6.31μ g/mL; IC
50
72h = 5,85μ g μ g/mL.) and
trypomastigote (LC
50
24h= 0.17μ g/mL) forms and decrease the amastigote s
urvival within
LLC-MK
2
. Analysis of the possible involvement of hydrogen
peroxide was performed by
catalase addition in medium, an enzyme that acts as
H
2
O
2
scavenger. The cell death showed
that the cytotoxic effect of BmLAAO is reduced but
not completely abolished by the catalase
presence. Confocal microscopy analysis of epimastig
otes treated with BmLAAO showed
staining with propidium iodide (PI), indicative of
loss of membrane integrity, and loss of
mitochondrial membrane potential, as observed by st
aining of treated cells with Rhodamine 123 (Rho123). Besides, the flow cytometry with anne
xin V and propidium iodide suggest
decrease of membrane permeability. Ultrastructural
analysis showed drastic morphological
changes on the parasite mitochondrion with ruptured
kDNA network. Increase of endoplasmic
reticulum profiles, enhanced electrondensity of mit
ochondrion and endoplasmic reticulum
membranes, loss of the parasite inner organization,
swelling of cell body with the appearance
of dismantling organelles, formation of myelin-like
structures indicative of autophagic
activity, were also observed in treated parasites.
In conclusion, the BmLAAO showed
cytotoxic effects on
T. cruzi
and this action is only partially dependent on H
2
O
2
production by
the BmLAAO. In addition, BmLAAO induced morphologic
al and physiological alterations
compatible with loss of viability and cell death === Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, continua a ser um problema de saúde pública nas Américas. No presente estudo, foram avaliados os efeitos da L-aminoácido oxidase isolatada do veneno da Bothrops marajoensis (LAAOBmar) sobre todas as formas evolutivas do T. cruzi. A atividade antiparasitária foi avaliada através da cultura de parasitas tratados com diferentes concentrações da fração em estudo. Epimastigotas foram cultivados em meio LIT, a 28ºC na presença LAAOBmar por 48 e 72 horas. Tripomastigotas foram obtidos a partir dos sobrenadantes de células LLC-MK2 infectadas, ressuspensos em meio MEM com 2% de FBS e tratados durante 24 h. LAAOBmar mostrou uma atividade significativa contra epimastigota (CI50 48h = 6,31μg/mL; CI50 72 h = 5,85μg/ml) e tripomastigotas (CL50 24h = 0,17μg/mL) e diminuiu a sobrevivência das formas amastigotas intracelular em células LLC-MK2. A análise do possível envolvimento do peróxido de hidrogênio foi realizada por adição de catalase no meio, uma enzima que atua como retirador de H2O2. A morte celular mostrou que o efeito citotóxico da LAAOBmar é reduzido, mas não completamente abolido pela presença da catalase. A análise por microscopia confocal de epimastigota tratados com LAAOBmar mostrou coloração com iodeto de propídio (IP), indicativo de perda de integridade da membrana, e perda do potencial de membrana mitocondrial, observado por coloração de células tratadas com rodamina 123 (Rod123) . Além disso, nos ensaios de citometria de fluxo com anexina V e iodeto de propídio sugerem diminuição da permeabilidade da membrana. A análise ultraestrutural de epimastigotas e tripomastigotas, mostrou alterações morfológicas drásticas na mitocôndria do parasita com a rede de kDNA rompido. O aumento de perfis de retículo endoplasmático, aumento da eletrondensidade das membranas mitocondriais, a perda da organização interna do parasita, inchaço do corpo da célula com o aparecimento de organelas deformada, formação de estruturas de mielina-like indicativo de atividade autofágica, também foram observados nos parasitas tratados. Em conclusão, o LAAOBmar mostrou efeitos citotóxicos em T. cruzi e esta ação é apenas parcialmente dependente da produção de H2O2 pela LAAOBmar. Além disso, LAAOBmar induziu alterações morfológicas e fisiológicas compatíveis com perda de viabilidade e a morte.
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