| Summary: | PEREIRA, D. A. Proteases e inibidores de proteases em látex vegetal e intestino de lagartas: aspectos sobre resistência e suscetibilidade das plantas alvo. 2014. 115 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. === Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-25T18:18:03Z
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Previous issue date: 2014 === Plant latex is produced and stored in channels formed by highly specialized cells structures. A remarkable feature of these fluids is the presence of complex proteolytic systems. Many studies report that latex possesses a variety of defense proteins against insects and fungi. However, some insects overlap this defense and feed on latex-producing plants, for example Pseudosphinx tetrio and Danaus plexippus, both of the order Lepidoptera. The biochemical aspects of insect resistance to latex defense proteins are still not widely elucidated. This issue was addressed in this work. Initially, the proteolytic activity of Pseudosphinx tetrio gut was characterized and evaluated in its ability to degrade latex proteins of its host plant (Plumeria rubra) and non-host plants (Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora). Furthermore, we assessed whether protease inhibitors from latex fluids (C. procera, P. rubra and Cr. grandiflora) inhibit intestinal proteases from P. tetrio and D. plexippus and vice versa. The effect of latex enzymes on peritrophic membrane (PM) of D. plexippus was also assessed. Intestinal proteases from P. tetrio are predominantly of serine type and their activities are higher in basic pHs. P. tetrio gut proteases rapidly and completely digested latex proteins of its host plant and C. procera and partially digested proteins from Cr. grandiflora. D. plexippus larvae were not affected when fed on artificial diet containing latex proteins (1%) from non-host plants. In vitro assays detected serine and cysteine peptidase inhibitors in both gut homogenates and latex fluids. Protease inhibitors from latex inhibited the proteolytic activity of gut homogenates of both larvae. Nevertheless, in vivo analysis demonstrated that latex inhibitors do not affect the development of D. plexippus. Only the gut homogenate from D. plexippus showed inhibitory activity towards proteases latex from its host plant (Calotropis procera). Slight changes were observed in the protein profile of the PMs from D. plexippus subjected to latex protein fractions in vivo, whilst in vitro treatment resulted in more severe damage. This study concludes that proteolysis and inhibition of proteolysis are involved in the defensive systems of both caterpillars and their host plants. Even though latex peptidase inhibitors inhibit gut peptidases (in vitro), the ability of gut peptidases to promptly digest latex proteins (in vivo) regardless of their origin seems to be a pivotal event favoring caterpillars overcoming plant defense. === O látex vegetal é produzido e estocado em sistemas de canais formados por células altamente especializadas, os laticíferos. Uma característica marcante destes fluidos é a presença de sistemas proteolíticos complexos. Muitos estudos relatam que proteínas de defesa contra insetos e fungos são encontradas em látex. No entanto, alguns insetos sobrepõem esta defesa e alimentam-se de plantas laticíferas, como Pseudosphinx tetrio e Danaus plexippus, ambas da ordem Lepidoptera. As bases bioquímicas da resistência de insetos às proteínas defensivas do látex ainda não são amplamente elucidadas. Esta problemática foi abordada neste trabalho. Inicialmente a atividade proteolítica do extrato intestinal de P. tetrio foi caracterizada e avaliada sua capacidade de degradar as proteínas do látex de sua planta hospedeira, Plumeria rubra, bem como de plantas laticíferas não hospedeiras (Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora). Além disso, foi avaliado se inibidores de proteases de fluidos laticíferos (C. procera, P. rubra e Cr. grandiflora) inibem as proteases intestinais de P. tetrio e D. plexippus e vice-versa. Em adição, foi analisado o efeito de enzimas laticíferas sobre a membrana peritrófica (MP) de D. plexippus. As proteases intestinais de P. tetrio são predominantemente do tipo serínica e suas atividades são maiores em pHs básicos. O extrato intestinal de P. tetrio rapidamente e completamente digeriu as proteínas do látex de sua planta hospedeira e de C. procera, bem como digeriu parcialmente as proteínas do látex de Cr. grandiflora. Larvas de D. plexippus se desenvolveram plenamente quando alimentadas com dieta artificial contendo 1% das frações proteicas dos látex de plantas não hospedeiras. Ensaios in vitro indicaram que ambos, extratos intestinais e látex das espécies em estudo, possuem inibidores de proteases serínicas e cisteínicas. Inibidores provenientes dos fluidos laticíferos em estudo inibiram a atividade proteolítica dos extratos intestinais de ambas as larvas. Entretanto, análise in vivo demonstrou que estes inibidores não afetam o desenvolvimento de D. plexippus. Somente o extrato intestinal de D. plexippus apresentou atividade inibidora de proteases do látex de sua planta hospedeira (Calotropis procera). Apenas discretas mudanças foram observadas no perfil proteico das MPs de D. plexippus submetidas às frações proteicas dos fluidos laticíferos in vivo, enquanto que o tratamento in vitro resultou em danos mais acentuados. A partir dos resultados obtidos conclui-se que proteólise e a inibição de proteólise fazem parte do sistema defensivo das larvas especialistas em plantas laticíferas e de suas plantas hospedeiras. Embora inibidores de proteases de fluidos laticíferos sejam capazes de inibir as proteases intestinais das larvas (in vitro), in vivo, a habilidade das proteases intestinais em prontamente digerir as proteínas do látex parece ser crucial para a sobreposição da defesa vegetal.
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