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Previous issue date: 2014 === Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil === A malária é causada por parasitos do gênero Plasmodium, sendo P. vivax a espécie mais amplamente distribuída no mundo. Em áreas endêmicas, é frequente a coinfecção em um mesmo indivíduo por diferentes variantes de P. vivax, caracterizando uma infecção múltipla. Nestas infecções, diferentes proporções das variantes podem ser relevantes na competição entre elas, na virulência e na resistência às drogas. O objetivo deste trabalho foi de avaliar a eficiência dos marcadores moleculares na identificação de infecções múltiplas por P.vivax. Desta forma, foram selecionados seis marcadores (MS06, MS07, MSP-3α, MSP-1B2, MSP-1B10 e MN21) caracterizados por polimorfismos de tamanho analisados por eletroforese capilar. Para cumprir este objetivo foram usadas três estratégias metodológicas. Inicialmente dois diferentes alelos amplificados de cada loci foram clonados em plasmídeos para o estabelecimento de infecções múltiplas artificiais.
Na segunda estratégia foram realizadas misturas artificiais de DNAs de pacientes com parasitemia e níveis de leucócitos semelhantes. E por fim, realizou-se a genotipagem de isolados de P. vivax de 47 pacientes da Amazônia Brasileira, sendo 22 pacientes com infecção múltipla previamente identificada. Ao simularmos infecções múltiplas artificiais com diferentes proporções de cada clone ou DNA de paciente verificamos que: (1) para os MS e TR, alelos menores foram preferencialmente amplificados por PCR; (2) para ambos os blocos da MSP-1, ocorreu titulação nos resultados; (3) para MSP-3α não houve amplificação preferencial do alelo menor; (4) a utilização do critério de altura mínima de ¼ da do pico predominante para a detecção dos alelos raros foi mais eficiente na detecção da multiplicidade de infecção. Na genotipagem de isolados de campo os marcadores MS06, MS07, MSP-1B10, MSP-3α e MN21 foram suficientes para detecção de 100% das infecções múltiplas em pacientes.
Assim, estamos propondo um painel de marcadores neutros (MS06, MS07 e MN21) e não neutros (MSP-3α e MSP-1B10) na detecção de infecções múltiplas utilizando o critério menos estringente para detecção dos alelos raros. === Plasmodium vivax infection is often characterized by the presence of two or more genetically distinct variants co-infecting the same human host (multiple-clone infection). Competition between co-infecting parasite clones is a major factor in the evolution of phenotypes such as virulence, transmissibility and drug resistance. Thus, accurate detection of multiple-clone P. vivax infections is very important for malaria control. The accuracy of P. vivax genotyping and multiple-clone infections characterization depend on several factors, such as the methods and the molecular markers of choice used in genotyping, the number of markers assessed, and the population diversity of the markers. Thus, the present study sought to evaluate the efficiency of different molecular markers – antigen-coding genes (MSP-1B2 , MSP-1B10), tandem repeat (MN21) and microsatellites (MS06 and MS07) – to detect multiple-clone P. vivax infections. In addition, this study enabled us to compare the efficiency of molecular markers to detect multiple-clone infections with well known proportions of clones. These six markers are characterized by size polymorphisms, being amplified by PCR and analyzed by capillary electrophoresis. Three methodological strategies were used. Initially, two different fragments for each lócus were cloned into plasmids for the establishment of artificial multiple-clone infections.
In the second strategy, artificial mixtures of DNA from patients with similar levels of parasitemia and leukocytes were performed. Finally, we genotyped 47 isolates of P. vivax from patients living in the Brazilian Amazon, being 22 patients with previously identified multiple-clone infections. From the artificial multiple-clone infections, the most important data were: (1) for microsatellites and the tandem repeat, the minor alleles were preferentially amplified by PCR; (2) for both blocks of the MSP-1, reliable estimates were obtained of the relative abundance of alleles present in clone mixtures; (3) for MSP-3α, no preferential amplification of the minor allele occurred, and (4) a minimum value of ¼ of the predominant peak for detection of rare alleles was more efficient in detecting the multiplicity of infection. For field isolate genotyping, a relevant result was that five markers - MS06, MS07, MSP-1B10, MSP-3α and MN21 - were sufficient for detection of 100% of multiple infections in patients.
Considering all these findings, we were able to define a panel of markers to be used in determining multiple-clone infections in epidemiological studies composed by neutral (MS06, MS07 and MN21) and non neutral (MSP-3α and MSP-1B10) markers using the less stringent criteria for detection of rare alleles.
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