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Previous issue date: 2013 === Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia === O complexo adaptador 1 (AP-1) atua na formação do revestimento de vesículas com
clatrina na rede trans-Golgi em células eucariontes. O conhecimento sobre o complexo AP-1
em tripanosomatídeos é escasso, mas já foi demonstrada sua importância na infectividade de
Leishmania mexicana em macrófagos, assim como na viabilidade de Trypanosoma brucei. O
Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado pertencente à família Trypanosomatidae,
sendo o agente etiológico da doença de Chagas, a qual afeta milhões de pessoas no mundo.
Neste contexto, esta dissertação teve como objetivo identificar os genes que codificam as
quatro subunidades do complexo AP-1 no genoma de T. cruzi, analisar sua expressão e
localização subcelular nesse parasita. Busca em banco de dados genômicos permitiu
identificar as sequências codificantes para todas as subunidades do complexo AP-1, sendo
obtidos os seguintes números de acesso gênicos: AP1-γ: XP_818958.1; AP1-β: XP_820334.1;
AP1-μ:XP_818899.1; AP1-σ: XP_804127.1. Foram produzidos anticorpos em camundongos
contra as proteínas recombinantes de todas as subunidades do complexo AP-1. Análise da
especificidade dos anticorpos foi realizada por western blot e a localização subcelular das
proteínas foi feita por imunofluorescência em microscopia de epifluorescência e microscopia
confocal a laser. Resultados negativos foram obtidos com o antisoro contra a subunidade
AP1-σ. Anticorpos obtidos contra as subunidades AP1-μ (policlonal) e AP1-β (monoclonal)
reconheceram polipetídeos de tamanho compatível ao peso molecular da proteína endógena
em extratos de formas epimastigotas, porém não reconheceram as proteínas por
imunofluorescência. O antisoro policlonal obtido contra a subunidade AP1-γ reconheceu em
extratos de diferentes formas evolutivas de T. cruzi (epimastigotas, tripomastigotas e
amastigotas) um polipeptídeo de peso molecular compatível com o predito em banco de dados
(~90 kDa). Imunolocalização demonstrou reação positiva pontual em região compatível com
a do complexo de Golgi deste protozoário: entre núcleo e cinetoplasto de formas
tripomastigotas e entre cinetoplasto e bolsa flagelar de epimastigotas e amastigotas.
Colocalização da AP1-γ com a GTPase Rab7 (marcador de complexo de Golgi em T. cruzi)
confirmou a localização desta subunidade no complexo de Golgi desse parasita. Nossos
resultados demonstram que as subunidades do complexo AP-1 são conservadas e expressas
em T. cruzi e que pelo menos a subunidade AP1-γ possui localização celular em complexo de
Golgi, similar ao que é descrito em outras células eucariontes. === The adaptor complex 1 (AP-1) acts in the formation of clathrin-coated vesicles at the trans-
Golgi network of eukaryotic cells. Knowledge about the AP-1 complex in trypanosomatids is
scarce, but it has been already demonstrated its importance in the infectivity of Leishmania
mexicana in macrophages, as well as the viability of Trypanosoma brucei. Trypanosoma cruzi
is a protozoan flagellate that belongs to the family Trypanosomatidae, being the etiologic
agent of Chagas disease, which affects millions of people worldwide. In this context, this
study aimed to identify the genes encoding the four subunits of the AP-1 complex in the
genome of T. cruzi and analyze their expression and subcellular localization in this parasite.
Search in genomic database identified gene sequences coding for all subunits of the AP-1
complex, the following accession numbers being obtained: AP1-γ: XP_818958.1; AP1-β:
XP_820334.1; AP1-μ: XP_818899 .1; AP1-σ: XP_804127.1. Antibodies were produced in
mice against recombinant proteins of all subunits of the AP-1 complex. Analysis of the
specificity of the antibodies was performed by western blot and subcellular localization of the
proteins by immunofluorescence was done by epifluorescence microscopy and confocal laser
microscopy. Negative results were obtained with the antiserum against subunit AP1-σ.
Antibodies raised against the AP1-μ (polyclonal) and AP1-β (monoclonal) subunits
recognized polypeptides with size compatible to the molecular weight of the endogenous
protein in extracts from epimastigotes, but no proteins could be localized by fluorescence
microscopy. The antiserum polyclonal obtained against the AP1-γ subunit recognized a
polypeptide in extracts of different evolutionary forms of T. cruzi (epimastigotes,
trypomastigotes and amastigotes) of molecular weight consistent with that predicted in
database (~90 kDa). Immunolocalization showed punctual positive reaction in the region
compatible with the Golgi complex of this protozoan: between nucleus and kinetoplast of
trypomastigotes and between kinetoplast and flagellar pocket of epimastigotes and
amastigotes. Colocalization of AP1-γ with the GTPase Rab7 (a marker of the Golgi complex
in T. cruzi) confirmed the location of this subunit in the Golgi apparatus of this parasite. Our
results demonstrate that the subunits of the AP-1 complex are conserved and expressed in T.
cruzi and that at least the AP1-γ subunit has cellular localization in the Golgi apparatus,
similar to that described in other eukaryotic cells.
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