Avaliação da pureza de soros antiofídicos brasileiros e desenvolvimento de nova metodologia para essa finalidade

• Main Author: Silva, Filipe Soares Quirino da
• Other Authors: Gemal, André Luis
• Language: Portuguese
• Published: 2014
• Subjects: Soros Antiofídicos; Predição de Epítopos; Peptídeos Sintéticos; Antivenenos; Espectrometria de Massas; Mapeamento de Epitopos; Controle de Qualidade; Vigilância Sanitária; Eletroforese em Gel Diferencial Bidimensional
• Online Access: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/8252

Made available in DSpace on 2014-08-26T17:15:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 11.pdf: 2987494 bytes, checksum: 91278cbfb140a22e4c4ae00434713079 (MD5) Previous issue date: 2008 === Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde === Nesse trabalho, analisou-se a pureza de soros antiofídicos utilizados no Programa Nacional de Imunizações. Fez-se a avaliação com base no teor e composição de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida, de soro antibotrópico. O principal componente identificado foi o fragmento F(ab)´2 – fração relevante para o efeito protetor do soro. Também se verificou a presença de proteínas contaminantes. Estas proteínas foram caracterizadas por western blot e espectrometria de massas, após a separação por eletroforese bidimensional. Os contaminantes identificados foram a IgG, albuminas eqüina e de asno, fragmentos da região variável da cadeia pesada e fragmentos de albumina. A concentração desses contaminantes varia bastante de um produtor para o outro, sendo que um dos produtores apresentou uma pureza substancialmente melhor que os demais. Desenvolveu-se um anticorpo para um método que visa a avaliação do conteúdo de imunoglobulina eqüina íntegra nos soros. Iniciou-se o desenvolvimento pela predição de epítopos na cadeia pesada da imunoglobulina eqüina, utilizando modelagem molecular. Nove prováveis epítopos foram identificados. O mapeamento dos epítopos utilizando a técnica de spot síntese confirmou a maioria das predições e possibilitou a identificação dos três mais reativos frente ao soro de coelho imunizado com IgG eqüina. Com base nesses resultados preparou-se um conjugado do peptídeo correspondente ao epítopo mais reativo com o toxóide tetânico. A imunização de coelhos com esse conjugado levou à obtenção de soro que apresentou reatividade frente à imunoglobulina eqüina, confirmando a possibilidade de seu uso como reativo para esse fim. Nenhum lote avaliado foi considerado insatisfatório frente à legislação vigente para soros antiofídicos. Da comparação da legislação em vigor com o estado da arte das indústrias de biotecnologia inferiu-se a necessidade de adequação desta lei, de maneira a considerar especificações que garantam uma melhor qualidade dos soros nacionais. Em função das diferenças nos resultados da avaliação de pureza das amostras de diferentes produtores, sugere-se a adoção de um programa de investimento para a nivelação tecnológica dos fabricantes. === A purity evaluation of antivenoms used in the Brazilian National Immunization Program was performed in this work. The main parameters used were total amount of protein and protein composition by SDS PAGE. The most important identified component was F(ab´)2 fragment, the relevant molecule for antivenom effect. Contaminant proteins were also present. These contaminants were characterized by western blot and mass spectrometry, after two dimensional electrophoresis separation. Identified contaminants were IgG, albumin horse and donkey, fragments from antibodies chains and albumin fragments. The amount of contaminants had a great variation from one producer to the other, and one manufacture had a better purification process than the others. A reagent for IgG identification in antivenoms was also developed. First, epitopes in horse IgG heavy chain were predicted using different molecular modeling methods. Eleven epitope candidates were identified. Epitope mapping confirmed most of the predicted sequences and the three most reactive epitopes were identified. With theses results, a conjugate between tetanus toxoid and a synthetic peptide was prepared. Rabbits were immunized with this conjugate, and after a second buster a high titer of antibodies against horse immunoglobulin was obtained. This serum has the potential applicalility to detect IgG in antivenoms. None of the batches was unsatisfactory to Brazilian guidelines for antivenom production. This guideline must be up dated, because it is old and the biotechnology industry had a lot of advances in last years. New regulatory specifications are the first step for better quality products. An investment program for the manufactures is also necessary, to adequate the purification process to most rigorous specifications.