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Previous issue date: 2012 === Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou === Transportadores ABC (ATP-binding cassette) abrangem proteínas transmembrana, que
utilizam a energia resultante da hidrólise de ATP, para transportar uma variedade de
moléculas através de membranas biológicas, incluindo drogas quimioterapêuticas. Alguns
membros dessa superfamília ABC estão associados com quimioresistência através da
superexpressão de proteínas de resistência a múltiplas drogas (multidrug resistance
associated protein – MRP). Uma dessas proteínas é a Pgp (P-glicoproteína), que está relacionada à resistência através da extrusão de compostos tóxicos da célula. O gene MRPA, um transportador da subfamília ABCC, está envolvido na resistência pelo sequestro do conjugado metal-tiol em vesículas próximas da bolsa flagelar da Leishmania. Neste estudo, formas promastigotas de populações sensíveis e resistentes ao antimonial trivalente
(SbIII) de quatro espécies de Leishmania, L. (V.) guyanensis, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensise L. (L.) infantum chagasi, foram analisadas quanto: a localização cromossômica, presença de amplificação extracromossomal e análise da amplificação do gene MRPA; níveis de mRNA dos genes MRPA e MRP; expressão da proteína Pgp e determinação do nível intracelular de SbIII. Ensaios de PFGE indicaram a associação de amplificação cromossomal e extracromossomal do gene MRPA com o fenótipo de resistência à droga nas espécies de Leishmania estudadas. Os resultados obtidos através dee lise alcalina dos parasitos mostraram a presença de amplificação extracromossomal apenas na amostra resistente de L. (V.) braziliensis. Análises de Southern blot com as endonucleases BamHI e HindIII indicaram a presença de polimorfismos na sequência do gene MRPA em algumas amostras de Leishmania analisadas. Adicionalmente, foi observada amplificação desse gene nas populações de Leishmania resistentes ao SbIII.
Ensaios de PCR quantitativo em tempo real mostraram aumento dos níveis de mRNA do
gene MRPA nas populações resistentes de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis,
comparado com seus respectivos pares sensíveis. Os níveis de mRNA do gene MRP estão aumentados em todas as populações de Leishmania resistentes ao SbIII analisadas neste estudo. Os resultados de Western blot revelaram que a proteína Pgp está mais expressa nas populações resistentes de L. (V.) guyanensis eL. (L.) amazonensis. Os dados obtidos de quantificação dos níveis intracellulares de SbIII por espectrometria de absorção atômica em forno de grafite mostraram uma redução no acúmulo de SbIII, nas populações resistentes de L. (V.) guyanensis,L. (L.) amazonensise L. (V.) braziliensis, quando comparadas às respectivas populações sensíveis. Nossos resultados indicam que os mecanismos de resistência ao antimônio são diferentes entre as espécies de Leishmania analisadas. === ATP-binding cassette (ABC) transporters comprise transmembrane proteins that use
energy from ATP hydrolysis to transport a variety of molecules across biological
membranes, including chemotherapeutic drugs. Some members of this ABC superfamily
are associated with chemoresistance by overexpression of multidrug resistance
associated proteins (MRP). One of these proteins is the Pgp (P-glycoprotein), which is associated with resistance by extruding toxic compounds outside the cell. The MRPA
gene, a transporter of ABCC subfamily, is involved in the resistance by sequestering
metal-thiol conjugate in vesicles close to the flagellar pocket of Leishmaniaparasite. In this study, promastigote forms of susceptible and trivalent antimony (SbIII)-resistant populations of four Leishmaniaspecies, L. (V.) guyanensis, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis and L. (L.) infantum chagasi, were analyzed for: chromosomal location, presence of extrachromosomal amplification and analysis of amplification of the MRPA gene; the mRNA levels of MRPA and MRP genes; Pgp protein expression and determination of intracellular SbIII level. PFGE analysis indicated the association of chromosomal and extrachromosomal amplification ofMRPA gene with SbIII-resistance phenotype in Leishmania species studied. The results obtained by alkaline lysis of these
Leishmanias amples showed the presence of extrachromosomal amplification only in the
SbIII-resistant L. (V.) braziliensis population. Southern blot analysis with the
endonucleases BamHI and HindIII indicated the presence of polymorphisms in the
sequence of MRPA gene in some Leishmania samples analyzed. Additionally, we
observed amplification of thisgene in all SbIII-resistant Leishmania populations
analyzed. Real-time quantitative RT-PCR assays showed increased levels of mRNA
MRPA gene in SbIII-resistant populations of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis
compared to their respective susceptible counterparts. The levels of mRNA MRP gene
are increased in all SbIII-resistant Leishmania populations analyzed in this study.
Western blot analysis revealed that Pgp protein is more expressed in SbIII-resistant L. (V.) guyanensisand L. (L.) amazonensispopulations. The intracellular level of SbIII quantified by graphite furnace atomic absorption spectrometry showed a reduction in the accumulation of Sb in SbIII-resistant L. (V.) guyanensis, L. (L.) amazonensisand L. (V.) braziliensis populations when compared to their respective susceptible populations. Our
results indicate that the mechanisms of antimony-resistance are different between
species of Leishmania analyzed.
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