| Summary: | Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-01-24T16:40:43Z
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Previous issue date: 2010 === Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil === Em tripanossomatídeos a regulação da expressão gênica ocorre principalmente em nível
pós-transcricional. Acredita-se que a estabilidade do mRNA e o acesso aos polissomos
sejam fortemente regulados, permitindo ao Trypanosoma cruzi uma rápida adaptação à
diferentes condições ambientais as quais está exposto durante seu ciclo de vida. A
regulação pós-transcricional requer uma associação entre mRNAs e determinadas
proteínas formando complexos ribonucleoprotéicos (mRNPs). Nosso objetivo foi
investigar a dinâmica de associação entre os mRNAs e proteínas, isolando e
caracterizando proteínas e complexos protéicos ligados a mRNAs poliA+ das frações
polissomal e pós-polissomal de epimastigotas em fase exponencial de crescimento e
epimastigotas sujeitos a estresse nutricional. As amostras obtidas foram analisadas por
espectrometria de massas (LC-MS/MS) e posteriormente comparadas. Nós identificamos
542 proteínas e dentre essas 24 estavam presentes em todas as frações analisadas,
enquanto que outras eram exclusivas de uma fração específica: epimastigota frações
polissomal (0,37%) e pós-polissomal (2,95%); estresse frações polissomal (13,8%) e pós-polissomal (40,78%). Proteínas sabidamente envolvidas com metabolismo de mRNA
foram identificadas, sendo que esse resultado é importante para confirmar a
confiabilidade da nossa técnica de isolamento das mRNPs. Essa abordagem em larga
escala possibilitou uma análise mais completa da composição dos mRNPs e a dinâmica
durante o estresse nutricional em T. cruzi. A partir dos dados obtidos nós selecionamos 6
proteínas para caracterização: fator de elongação 1-alfa (EF1-), proteína de ligação a
RNA com domínio dedo de zinco (ZF-211.70), proteína de ligação a RNA com domínio
cold shock (CD-33.60), prostaglandina F 2 alfa sintase (PF2 S), prostaglandina F sintase
(PFS) e uma proteína hipotética com domínio de fator de replicação A (Hip -11.150). Os
anticorpos contra as proteínas EF1-, ZF-211.70, PF2S e PFS apresentaram reatividade
específica com uma proteína única de tamanho esperado, já as proteínas CD-33.60 e Hip-11.150 apresentaram um reatividade baixa ou inexistente em extratos de epimastigotas e
por isso não foram utilizadas para os ensaios posteriores. Ensaios de imunofluorescência,
sedimentação de polissomos em gradiente de sacarose e expressão ao longo do ciclo de
vida nos permitiu uma caracterização inicial das proteínas selecionadas, etapas
importantes para aprofundarmos o estudo na regulação de expressão gênica em T. cruzi. === Gene regulation is mainly posttranscriptional in trypanosomatids. The stability of mRNA
and access to polysomes are thought to be tightly regulated, allowing Trypanosoma cruzi
to adapt to the different environmental conditions during its life cycle. Posttranscriptional
regulation requires the association between mRNAs and some proteins to form mRNP
complexes. We investigated the dynamic association between proteins and mRNAs, using
poli(T) beads to isolate and characterize proteins and protein complexes bound to poli -A+
mRNAs. The protein content of these fractions was analyzed by mass spectrometry (LC -MS/MS). We identified 542 protein component of the mRNP complexes associated with
mRNAs. Twenty-four of the proteins obtained were present in all fractions, whereas some
other proteins were exclusive to a particular fraction: epimastigote polysomal (0.37%) and
postpolysomal (2.95%) fractions; stress polysomal (13.8%) and postpolysomal (40.78% )
fractions. Several proteins known to be involved in mRNA metabolism were identified,
and this was considered important as it made it possible to confirm the reliability of our
mRNP isolation approach. This procedure allowed us to have a first insight into the
composition and dynamics of mRNPs in T. cruzi. From the results obtained we selected
six proteins for characterization: elongation factor 1-alpha (EF1-), zinc finger RNA
binding protein (ZF-211.70), RNA binding protein with a cold-shock domain (CD-33.60),
prostaglandin F 2 alfa synthase (PF2S), prostaglandin F synthase (PFS) and a
hypothetical protein with a replication factor domain (Hip-11.150). The antibodies
produced against EF1-, ZF-211.70, PF2S and PFS recognized a specific protein of
expected size in epimastigote protein extracts; however, the CD-33.60 and Hip-11.150
antibodies did not recognized a specific protein and they were not used for further
experiments. Immunofluorescence assays, polysome profile in sucrose density gradient
and the expression pattern through the parasite life cyle with the selected proteins allowed
us a preliminary characterization and further studies will help to elucidate the
posttranscriptional regulation and the formation of RNA regulons in T. cruzi.
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