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Previous issue date: 2011 === Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. === A eritropoetina é o hormônio responsável pela regulação da produção de células
vermelhas. A eritropoetina humana recombinante (rhEPO) produzida em laboratório e usada
como medicamento pode apresentar as isoformas alfa e beta, chamadas de alfaepoetina e
betaepoetina humana recombinante. O tratamento com rhEPO melhora bastante a vida de
pacientes anêmicos e/ou em diálise, reduzindo a necessidade de transfusão de sangue. A
grande demanda por este biofármaco justifica o esforço de pesquisa não só para conhecimento
de seus mecanismos de ação e desenvolvimento de processos de produção, como também
para controle da qualidade do produto. É de grande importância o desenvolvimento de
métodos de análise que diminuam a margem de erro e aumentem a precisão e a confiabilidade
dos resultados, além de reduzir o tempo de liberação para o mercado.
O ensaio de determinação da potência da alfaepoetina humana recombinante
produzida por Bio-Manguinhos é realizado pelo método de camundongos normocitêmicos,
com contagem de reticulócitos por microscopia. Estemétodo de contagem é demorado, pouco
preciso e desgastante para o analista. O objetivo deste trabalho é estudar o uso do método de
citometria de fluxo na contagem de reticulócitos para o ensaio de potência da alfaepoetina
humana recombinante. Visando a implantação do método no Departamento de Controle de
Qualidade (DEQUA) de Bio-Manguinhos, o desenvolvimento deste trabalho teve também
como objetivo comparar a sua eficácia em relação aoprocesso atualmente utilizado, e a
realizar os testes necessários à sua validação.
Os camundongos foram inoculados com três doses diferentes de amostra ou material
de referência e os reticulócitos presentes no sangue coletado foram marcados com o corante
fluorescente laranja de tiazol (Retic-COUNT). Os reticulócitos foram contados em citômetro
de fluxo FACSCalibur e seu percentual foi utilizadopara a determinação da potência de
acordo com os cálculos da Farmacopéia Européia 6ª edição. Para a comparação entre os
métodos, vinte lotes de alfaepoetina humana recombinante produzidos por Bio-Manguinhos
tiveram sua potência determinada pela contagem de reticulócitos por citometria e
microscopia. Para a determinação da repetitividade e da precisão intermediária, foi utilizado
um único lote de alfaepoetina humana recombinante. Para avaliar a concordância entre os
métodos de citometria de fluxo e microscopia, foi utilizado o teste estatístico de Bland-Altman, com comparação dos vinte resultados obtidoscom os mesmo lotes, analisados a
partir das mesmas amostras de sangue.
Os resultados apresentaram boa repetitividade e precisão intermediária e mostraram
que os métodos são equivalentes no que diz respeitoà determinação da potencia da rhEPO
produzida por Bio-Manguinhos. No entanto, em funçãoda alta probabilidade de erros
associados ao método de microscopia, a introdução da citometria de fluxo mostra-se uma
alternativa bastante promissora para suprir a demanda de testes com precisão,
reprodutibilidade e maior velocidade de liberação de lotes. === Erythropoietin is the hormone responsible for the regulation of the red cells’
production. The recombinant human erythropoietin (rhEPO) produced in laboratory and used
as a drug exists in the alpha and beta isoforms, called alpha epoietin and beta epoietin. The
treatment with rhEPO improves the life of anemic patients and/or on dialysis, reducing the
need for blood transfusion. The high demand for this biopharmaceutical product justifies the
research effort not only for the knowledge of its mechanisms of action and development of
production processes, but also for the product quality control. The development of quality
control methods able to reduce errors and increase the accuracy and the reliability of the
results, along with a reduction in the release timeto the market, is of great importance.
The assay to determine the biological activity of the recombinant human alpha
epoietin produced in Bio-Manguinhos is performed bythe normocythaemic mice method and
reticulocyte counting by microscopy. This counting method is time consuming, imprecise and
stressful to the analyst. The present study aimed to study the use of the flow cytometric
method for reticulocyte counting in the biological activity assay for the human alpha epoietin.
Intending to implement this new method in the Quality Control Department of
Bio-Manguinhos, this work also compared its effectiveness with the currently used method,
and the tests required to its validation were performed.
The mice were inoculated with three different dosesof sample and reference material,
and the reticulocytes on the collected blood were stained with the fluorescent dye thiazole
orange (Retic-COUNT). The reticulocytes were counted in a FACSCalibur flow cytometer
and their percentage was used for the biological activity determination in accordance with the
European Pharmacopoeia 6
th
edition. To compare the methods, the biological activity of
twenty batches of recombinant human alpha epoetin produced by Bio-Manguinhos was
determined trough both cytometry and microscopy. Tothe determination of repeatability and
intermediate precision, only a single batch of recombinant human alpha epoetin was used. For
the evaluation of agreement between both methods, the Bland-Altman test was used to the
compare the twenty results obtained from the same batches, analyzed from the same blood
samples.
The results showed good repeatability and intermediate precision and indicated that
the two methods are equivalent when it concerns thedetermination of the rhEPO biological
activity. However, due to the high probability of errors associated with the microscopy
method, the introduction of the flow cytometry method seems to be a promising alternative to
meet the demand for analyses with precise and reproducible results, along with a good speed
in releasing batches for the market.
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