Um ensaio de adesão otimizado para o estudo de interações entre macrófagos e tecido conjuntivo baseado no ensaio de Stamper-Woodruff

• Main Author: Carvalhal, Djalma Gomes Ferrão
• Other Authors: Savino, Wilson
• Language: Portuguese
• Published: 2012
• Subjects: Macrófagos; Moléculas de adesão celular; Leishmania; Macrophages; Adhesion molecules; Connective tissue
• Online Access: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/5886

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio ([e-mail]) on 2012-11-27T18:25:19Z No. of bitstreams: 1 Djalma Gomes Ferrão Carvalhal Um ensaio de adesao... 2001.pdf: 31649822 bytes, checksum: cea5fde124b280c0b60a4b69bc0b6cb3 (MD5) === Made available in DSpace on 2012-11-27T18:25:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Djalma Gomes Ferrão Carvalhal Um ensaio de adesao... 2001.pdf: 31649822 bytes, checksum: cea5fde124b280c0b60a4b69bc0b6cb3 (MD5) Previous issue date: 2001 === Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil === O objetivo deste trabalho é desenvolver um ensaio de adesão, baseado no ensaio de Stamper- Woodruff, para o estudo das interações entre macrófagos e matriz conjuntiva. Foram induzidos bolsões inflamatórios em camundongos da linhagem BALB/c para obtenção de secções de pele inflamada, e células macrofágicas da linhagem J774G.8 foram utilizadas na padronização do ensaio. Secções de 7 i^m de espessura foram colocadas em lâminas de vidro, fixadas com acetona e bloqueadas com BSA. Foi estabelecida a concentração de 10® células/100 fil como a mais apropriada para a realização do ensaio, através de diluições seriadas. Células J774G.8 sem tratamento prévio ou tratadas com: ácido tetraacético diamino etileno, Mn++, lipopolissacarídeo, forbol miristato acetato, zimosan, os peptídios CS-1 e RGD, os anticorpos anti-CD49d ou contra a cadeia (32 de integrinas, foram adicionadas ás secções e incubadas por 30 minutos á temperatura ambiente. Como resultado, as células macrofágicas aderem preferencialmente ás áreas de inflamação. A adesão das células é dependente de cátions divalentes e pode ser modulada por substâncias que promovam a ativação celular. Além disso, a adesão mediada por integrinas pode ser inibida por peptídios RGD e CS-1 ou com anticorpos contra integrinas da família (31 e (32. A adesão das células macrofágicas é inibida mais intensivamente pela infecção com Leishmania mas não com a infecção por Mycobacterium ou por fagocitose de partículas de látex. Desta forma, o ensaio desenvolvido foi capaz de demonstrar a especificidade da adesão de células macrofágicas pela matriz conjuntiva bem como de sugerir a existência de mecanismos específicos de regulação das interações entre macrófagos e a matriz conjuntiva durante a infecção por Leishmania. === The aim of this work was to develop an adhesion assay, based on the Stamper-Woodruff’s assay to study the interactions between macrophages and the connective matrix. Inflammatory pouches were produced in BALB/c mice to obtain inflammed skin sections, and J774G.8 macrophage cell line was applied to standardize the assay. Sections of 7|im thick were placed onto glass slides, fixed with acetone and blocked with bovine serum albumin. The cell concentration of 10®/100 |xl was proved to be most appropriate for the assay, through serial dilutions. J774G.8 cells, with or without ethylene diamine tetraacetic acid, Mn'"'", Lipopolysaccharide, phorbol myristate acetate, zymosan, CS- 1, RGD peptide, antibodies anti-CD49d or against (32 chain integrin treatment, were added onto the sections and incubated for 30 minutes at room temperature. Macrophage cells adhered preferentially to inflammed areas. The adhesion of cells was dependent on divalent ions and could be modulated by substances that promote cell activation. Moreover, the adhesion mediated by integrin can be inhibited either by RGD or CS-1 peptides or by antibodies against integrins of the |31 or |32 sub-family. Adhesion of macrophage cells was intensively inhibited by infection with Leishmania and was not affected by infection with Mycobacterium or by endocytosis of latex beads. Thus, the developed assay was able to show the specific adhesion of macrophages to connective matrix, as well to illustrate a specific downregulation of macrophage adhesion to inflammed skin in Leishmania infection.