Detecção de micoplasmas por reação em cadeia da polimerase (PCR) em produtos intermediários da vacina contra a febre amarela produzida em Bio-Manguinhos/Fiocruz

• Main Author: Ferreira, Rafael Lawson
• Other Authors: Cosendey, Maria Helena
• Language: Portuguese
• Published: Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos 2012
• Subjects: Micoplasma; Reação em Cadeia da Polimerase; Controle de Qualidade; Vacina contra Febre Amarela; Mycoplasma; Polymerase Chain Reaction; Quality Control; Yellow Fever Vaccine
• Online Access: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/5820

Submitted by Priscila Nascimento ([e-mail]) on 2012-11-16T12:24:56Z No. of bitstreams: 1 rafael-lawson-ferreira.pdf: 3259100 bytes, checksum: 120506960b3b1958e6509f56db6fef38 (MD5) === Made available in DSpace on 2012-11-16T12:24:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rafael-lawson-ferreira.pdf: 3259100 bytes, checksum: 120506960b3b1958e6509f56db6fef38 (MD5) Previous issue date: 2007 === Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. === O Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos - Bio-Manguinhos/ FIOCRUZ (BM) é um importante centro de produção de imunobiológicosna América Latina. Dentre as vacinas produzidas em Bio-Manguinhos, sob condiçõesde boas práticas de fabricação, a vacina contra Febre Amarela (VcFA), produzida a partir de ovos embrionados SPF, é certificada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária e Organização Mundial de Saúde para suprir a demanda do Ministério da Saúde e das Agências das Nações Unidas. Para garantir a segurança da vacina assim como a ausência de agentes adventícios, testes de Controlede Qualidade (CQ) devem ser realizados na matéria-prima e nas diferentes etapasda produção. Por recomendação da Organização Mundial de Saúde, em vacinas produzidas para o uso humano deve ser demonstrada a ausência de M. oralee M. pneumoniaee quando material de origem aviária é utilizado durante a produção, ausência de M. gallisepticume M. synoviae. Da mesma forma como o desenvolvimento de novos produtos tem evoluído, o CQ deve seguir estas novasabordagens cujos benefícios imediatos seriam a rapidez na liberação de resultados, maior sensibilidade e especificidade. O micoplasma é um importante agenteadventício amplamente encontrado em diferentes tipos de substratos biológicos, porém é um microrganismo fastidioso e de difícil detecção pelo exame direto (cultura do microrganismo) o qual requer um longo prazo para obtenção de resultados, cerca de 35 dias. Em nosso trabalho selecionamos o par de oligonucleotídeos iniciadores GPO-1 e MGSO com o objetivo de estabelecer um teste para detecção de micoplasmas por PCR no CQ da VcFA. Os oligonucleotídeos selecionados amplificam fragmentos de aproximadamente 700 pb na região do gene do rDNA 16S. Foram testadas diferentes metodologias de extração de DNA, como fervura, fenol/clorofórmio e kits comerciais avaliando a adaptabilidade da técnica para os diferentes produtos intermediários. A metodologia proposta, neste trabalho, foi capaz de detectar M. pneumoniaeem concentrações entre 6,25 e 3,125 UFC/mL e M. synoviaeentre 12,5 e 6,25 UFC/mL, em produtos intermediários intencionalmente contaminados, em concentrações inferiores do que as preconizadas pela OMS. Além disso, os oligonucleotídeos selecionados demonstraram especificidade pelas espécies de micoplasmas utilizadas, não apresentando amplificação quando o DNA de outras espécies bacterianas foi utilizado. Paralelamente, foi realizado um ensaio de polimorfismo do comprimento dos fragmentos da restrição (RFLP) para identificação da espécie de micoplasma, onde selecionamos as enzimas de restrição MboI e HinfI, capazes de diferenciar as três espécies de micoplasmas de referência utilizadas (M. gallisepticum, M. pneumoniaee M. synoviae). === The Institute of Technology in Immunobiologicals - Bio-Manguinhos/ FIOCRUZ is an important immunobiological production center in Latin America. Among the vaccines produced in Bio-Manguinhos under good manufacturingpractice, the vaccine against Yellow Fever (YF-Vaccine), produced in SPF embrionated eggs, is certified by the Brazilian National Surveillance Agency and World Health Organization to achieve the demand of the Brazilian Ministry of Health and the United Nations Agencies. In order to guarantee the safety of the vaccine as well as the absence of contaminant agents, tests of Quality Control (QC) must be done along its production. By advice of WHO, on vaccines produced for human use, there must be demonstrated the absence of M. oraleand M. pneumoniae. When poultry material is used during the production, absence of M. gallisepticumand M. synoviae is also required. Mycoplasma is a fastidious microorganism of difficult detection through culturing, which requires a long term for conclusive results, about 35 days. We selected the primer pair GPO-1 and MGSO to establish a mycoplasma detection through PCR in YF-Vaccine. The selected oligonucleotides amplify fragments of roughly 700 bp in the 16S rRNA gene region. Different methodologies of DNA extraction were performed, such as boiling, phenol/chloroform and commercial kits, thus, evaluating the adaptability of each method for the intermediary products. The proposed methodology in this study was capable to detect M. pneumoniaein concentration between 6,25 and 3,125 CFU/mL and M. synoviae,between 12,5 and 6,25 CFU/mL, in spiked intermediate products which constitute lower detection limits throw thosestipulated by WHO. In addition, selected oligonucleotides demonstrated specificity to the Mycoplasma species used in this work, not presenting amplification productswhen other bacteria species was used. Three reference mycoplasmas species (M. gallisepticum, M. pneumoniaeand M. synoviae) could be differentiated based on restriction fragments length polymorphism (RFLP) after digestion of the amplification products by HinfI and MboI.