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Previous issue date: 2010 === CNPq e PEC-PG === Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. === As leishmanioses formam um grupo de doenças antropozoonóticas, endêmicas em 88 países e
presentes em quase todos os estados brasileiros. O desenvolvimento de uma vacina contra das
leishmanioses é altamente desejável já que a terapia e as características biológicas e
ecoepidemiólogicas dos parasitos e seus vetores associados não facilitam o controle da
doença. Kinetoplastid Membrane Protein-11 (KMP-11) é uma molécula candidata a vacina
contra as leishmanioses. Utilizando ferramentas in vitro e in silico, foi avaliada a
antigenicidade de 13 peptídeos sintéticos abrangendo a sequência inteira de KMP-11. Para os
estudos in vitro foram usadas células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de
pacientes com leishmaniose cutânea (LC) do estado do Rio de Janeiro. Estas células foram
empregadas para testar a antigenicidade dos 13 peptídeos individualmente e da proteína
integral KMP-11 recombinante, através de ensaios de ELISA e ELISPOT. Na dosagem de
citocinas por ELISA observamos que a proteína KMP-11 recombinante estimulou respostas
de citocinas quase sempre superiores às induzidas pelos peptídeos isolados. No que se refere a
IFN-, dois dos 13 peptídeos (P9 e P10) estimularam níveis desta citocina significativamente
(p<0,05) mais baixos do que os observados com a proteína inteira. Dez peptídeos (P4, P5, P6,
P7, P8, P9, P10, P11, P12 e P13) apresentaram níveis de IL-10 e TNF-α significativamente
inferiores aos observados com a proteína inteira. KMP-11 mostrou-se um potente indutor de IL-10 em PBMC de pacientes com LC, confirmando resultados anteriormente publicados,
mas também foi capaz de induzir a produção de IFN-γ e altos níveis de TNF-α, em níveis
superiores aos dos peptídeos estudados. Na avaliação da razão IFN-γ/IL-10 observou-se um
acentuado contraste entre a maioria dos peptídeos e a proteína KMP-11. As respostas a 11 dos
13 peptídeos mostraram um claro viés de resposta de tipo 1 (IFN-γ>IL-10), a exceção dos
peptídeos P1 e P10 (IFN-γ<IL-10). Na resposta à proteína recombinante KMP-11 houve um
forte predomínio da produção de IL-10 sobre a de IFN-γ. Observou-se uma grande variação
na produção de citocinas estimuladas pelos peptídeos entre os pacientes envolvidos nas
análises. Foi realizado um estudo in silico para predizer quais as sequências de KMP-11 que
teriam maior potencial antigênico através do algoritmo SYFPEITHI, que revelou que os
peptídeos estudados são promíscuos para a maioria dos alelos de HLA de classe I e II
analisados. Para HLA de classe II, P4 mostrou scores significativamente maiores em relação a
todos os outros peptídeos (p<0,05), exceto P10 e P12. Para HLA de classe I os valores de
score para o peptídeo P1 foram significativamente mais altos que os valores dos peptídeos P4,
P10 e P11 (p<0,05). Por outro lado, os valores de score para o peptídeo P11 foram
significativamente mais baixos que os dos peptídeos P1, P2, P5, P6, P12 e P13 (p<0,05). Os
peptídeos P3, P4 e P11 apresentaram valores negativos de score, indicando que eles contêm,
dentro das respectivas sequências, aminoácidos que interferem ou que desfavorecem a
interação e ligação com os diferentes alelos de HLA I. Adicionalmente, foram utilizadas as
ferramentas PAPROC, MAPP e NetChop que possibilitaram predizer que sequências contidas
em P1, P5 e P6 seriam produzidas naturalmente pela maquinaria proteolítica. O algoritmo
PHYRE predisse que KMP-11 apresentava uma conformação de “grampo” com hélices-α
ligadas por uma alça. Adicionalmente este programa predisse a estrutura tridimensional da
proteína. O algoritmo PROTSCALE mostrou que KMP-11 possui três regiões de alta
polaridade entre os aminoácidos 14-29, 34-36 e 44-71. o que estaria relacionado com a
estrutura tridimensional já mencionada. Finalmente, a análise de nível de conservação de
KMP-11 confirmou que esta molécula é bem conservada nos cinetoplastídeos, porém
possibilitou discriminar as sequências dos genes codificadores da proteína no gênero
Leishmania das existentes nos gênero Trypanosoma e Crithidia. Os resultados obtidos na
análise bioinformática estavam, em parte, de acordo com os obtidos na parte experimental
(imunológica) do presente estudo e em estudos anteriores sobre KMP-11. === Leishmaniases are a group of antropozoonotic diseases, endemic in 88 countries and present
in almost all Brazilian states. The development of vaccines against leishmaniasis is highly
desirable because neither the therapy nor the biological and ecoepidemiologic characteristics
of parasites and their associated vectors facilitate the disease control. Kinetoplastid Membrane
Protein-11 (KMP-11) is a vaccine candidate molecule against leishmaniasis. Using in vitro
and in silico tools, we evaluated the antigenicity of 13 synthetic overlapping peptides
covering the entire sequence of KMP-11. For the in vitro experiments we used peripheral
blood mononuclear cells (PBMC) from patients with cutaneous leishmaniasis (LC) from Rio
de Janeiro State. These cells were employed to test the antigenicity of the 13 peptides
individually, using ELISA and ELISPOT. By using ELISA we observed that recombinant
KMP-11 induced higher cytokine responses than most of the individual peptides. Concerning
IFN-γ two peptides (P9 and P10) induced cytokine levels significantly lower (p<0.05) than
the entire protein. Ten peptides (P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 e and P13) induced
significantly lower IL-10 and TNF-α levels than those observed with the entire protein. KMP-
11 was a potent inducer of IL-10 production in PBMC cultures from LC patients, confirming
previously published observations. It was also capable of inducing higher levels of IFN-γ and
TNF-α as compared to the studied peptides. In the evaluation of the IFN-γ/IL-10 ratio, we
observed a marked contrast between most of the peptides and KMP-11. The responses to 11
out of 13 peptides presented a clear type 1 bias (IFN-γ>IL-10), except P1 and P10, which showed a type 2 response (IFN-γ<IL-10). The response with the entire recombinant protein
IL-10 production predominated over that of IFN-γ. High variability in cytokine production
among the patients was observed. An in silico study was made to predict KMP-11 sequences
with antigenic potential with the SYFPEITHI algorithm. This analysis has revealed that the
studied peptides were promiscuous for most of the class I and class II HLA alleles analyzed.
For class II HLA, P4 showed scores significantly higher than the other peptides (p<0.05),
except those of P10 and P12. For class I HLA, the score values for P1 were significantly
higher than those for P4, P10 and P11 (p<0.05). On the other hand, the score values for the
P11 were significantly lower than those for P1, P2, P5, P6, P12 and P13 (p<0.05). The P3, P4
and P11 peptides showed negative score values, indicating that they contain amino acids that
interfere with the binding to HLA I molecules. In addition to this, we used the PAPROC,
MAPP and NetChop tools that have predicted that sequences contained in P1, P5 and P5
would be naturally produced by the proteolytic machinery. The PHYRE algorithm has
predicted that KMP-11 has a "hairpin" conformation with two alpha-helixes joined together
by a loop. Additionally this software has predicted the tridimensional structure of the protein.
The PROTSCALE algorithm revealed three regions of high polarity in the KMP-11 molecule
(at the positions 14-29, 34-36 and 44-71), what would be related to the tridimensional
structure already mentioned. Finally, the analysis of KMP-11 conservation confirmed that this
molecule is highly conserved in Kinetoplastidae, However, it was able to distinguish the
sequences of the KMP-11-coding genes in the genus Leishmania from those existent in
Trypanosoma and Crithidia. The results obtained in the bioinformatic analysis were partially
in agreement with those obtained in the experimental (immunologic) part of the present study
and in previous studies on KMP-11.
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