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Previous issue date: 2015 === Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil === Ensaios de PCR para o diagnóstico e monitoramento da carga parasitária em pacientes acometidos pela doença de Chagas são realizados a partir de DNA recuperado de sangue periférico. Uma perspectiva seria a possibilidade do uso de soro para a detecção e quantificação de DNA de T. cruzi, aproveitando amostras coletadas para triagem sorológica em laboratórios de referência e bancos de sangue. Outra limitação é que o diagnóstico molecular com os alvos mais comumente utilizados (kDNA, DNA Satélite) não é capaz de identificar as linhagens do parasito. Tem sido relatada uma baixa sensibilidade para alguns marcadores de genotipagem de T. cruzi quando aplicados diretamente em sangue de pacientes crônicos, uma vez que são cópias únicas ou distribuídos em baixa frequência no genoma do parasito. Estudos baseados em famílias multigênicas, como as proteínas de superfície (trans-sialidases), sugerem que estas sejam capazes de reunir cepas/isolados de T. cruzi em grupos biologicamente distintos, visando sua caracterização. A presença de sítios polimórficos nas regiões não traduzidas (UTRs) dos genes de trans-sialidases (TS), além de representar uma estratégia de sobrevivência do parasito ao estresse ambiental, propicia o uso destas regiões como potenciais marcadores moleculares para tipagem de T. cruzi. Este trabalho avaliou o potencial uso do soro e do segmento 5\2019 UTR de TS de T. cruzi, em ensaios de quantificação de DNA e genotipagem do parasito, respectivamente
Neste sentido, empregamos a PCR em Tempo Real (qPCR) multiplex para a detecção/quantificação de T. cruzi em amostras pareadas de soro e sangue de 40 pacientes com a doença crônica. Para avaliar o uso da 5\2019 UTR de TS como marcador molecular de genotipagem, utilizamos um painel de cepas/clones de T. cruzi, representantes das seis DTUs (Unidades Discretas de Tipagem). Após amplificação do segmento contendo parte da 5\2019 UTR e uma porção da região codificante de TS das diferentes cepas/clones, e posterior sequenciamento por método capilar (SANGER), realizamos a análise composicional das sequências. Em seguida, novos iniciadores foram desenhados para os ensaios de COLD-PCR HRM (High Resolution Melting). Os resultados da qPCR revelaram sensibilidade de detecção de 95% e 97% para soro e sangue, respectivamente, e especificidade de 100% para ambos os tipos de amostras. As medianas de carga parasitária em soro e sangue, também não demonstraram diferenças significativas, sendo de 1,12 e 1,23 equivalentes parasito/mL, respectivamente, o que reproduz a baixa parasitemia observada nos pacientes com doença de Chagas crônica. A partir das análises composicionais das sequências de 5\2019 UTR de TS obtidas pelo método capilar, identificamos blocos conservados e sítios polimórficos entre as linhagens, porém não foi possível gerar assinaturas genômicas associadas à caracterização em DTUs. O sequenciamento New Generation Sequencing do segmento 5\2018 UTR de TS permitiu a caracterização das cepas/clones em seis DTUs, como demonstrado na árvore filogenética construída a partir de 4.568.225 sequências
Os ensaios de COLD-PCR HRM, direcionados para diferentes seções do segmento 5\2019 UTR de TS, foram eficientes em agrupar cepas/clones em duas variantes, sugerindo uma associação com os ciclos de transmissão, virulência e evolução populacional destes parasitos. Os resultados gerados no presente estudo sugerem o uso de soro para o diagnóstico molecular da infecção pelo T. cruzi em laboratórios de referência, responsáveis pela manutenção de sorotecas, bem como demonstram o potencial discriminatório do alvo 5\2019 UTR de trans-sialidases para ser explorado em ensaios de genotipagem do parasito diretamente de amostras clínicas e biológicas, acoplado ao sequenciamento High Throughput dos produtos amplificados, como ferramenta complementar à pesquisa diagnóstica da doença de Chagas === Abstract: PCR-based assays for molecular diagnosis and to evaluate Trypanosoma cruzi load in patients with Chagas disease are usually performed with DNA recovered from peripheral blood samples. One promising approach would be the use of patients\2019 serum for the detection and quantification of T. cruzi DNA, as it would make possible to take advantage of the same samples collected for serological screening in blood banks and reference laboratories. Another limitation is that molecular diagnosis with the most common molecular targets (kDNA and Satellite DNA) is not suitable for identifying the infecting parasite strain. A low sensitivity of some T. cruzi genotyping markers has been reported, when those are applied directly to blood of chronic patients, since they are represented as a single copy or present low frequencies in the parasite genome. Studies based on multigene families, such as the surface proteins (trans-sialidase), suggested the ability of those genes to cluster strains/isolates of T. cruzi into biologically distinct groups. The presence of polymorphic sites in the untranslated regions (UTRs) of trans-sialidase genes (TS), as well as represents a parasite\2019s survival strategy to environmental stress, it promotes the use of these regions as potential molecular markers for T. cruzi typing. This study evaluated the potential use of serum and the segment 5' UTR of TS, as new approaches for DNA quantification and T. cruzi genotyping, respectively
We used multiplex Real-Time PCR (qPCR) for detecting/quantifying parasites in serum and blood paired samples from 40 chronic Chagas disease patients. In order to investigate the potential use of 5' UTR of TS sequences as molecular markers for genotyping, we used a panel of T. cruzi strains/clones, representative of the six DTUs (Discrete Typing Units). Following amplification of the segment containing part of the 5' UTR and a portion of the TS coding region from different strains/clones and sequencing by capillary method (Sanger), we carried out the compositional analysis of the sequences. New primers were designed for the HRM COLD-PCR tests (High Resolution Melting). The qPCR results showed detection sensitivities of 95% and 97% for serum and blood, respectively, and a specificity of 100% for both sample types. The median of parasite load in blood and serum also showed no significant differences, with 1.12 and 1.23 parasite equivalents/mL respectively, which reproduces the low parasitemia observed in chronic Chagas disease patients. From the compositional analysis of the 5\2019 UTR of TS sequences obtained by capillary method, we identified conserved blocks and polymorphic sites, but no genomic signatures associated to the characterization into distinct DTUs were observed. New Generation Sequencing of the segment 5' UTR of TS allowed the characterization of strains/clones in six DTUs, as shown by the phylogenetic tree generated by the analysis of 4.568.225 sequences
HRM COLD-PCR assays targeted to different sections of the segment 5' UTR of TS were effective for clustering the strains/clones in two variants, suggesting an association with the transmission cycles, virulence and evolution of these parasite populations. The set of evidences gathered in this study, reinforces the potential use of serum for molecular diagnosis of T. cruzi infection, in reference laboratories responsible for maintaining serum bank, as well as, indicates a discriminatory potential of 5\2019 UTR of TS, regarding the six DTUs, to be explored in genotyping assays directly from clinical and biological samples, associated to High Throughput sequencing of amplicons, as a complementary tool for diagnostic researches in Chagas disease
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