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Previous issue date: 2015 === Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil === As calpaínas são cisteíno-peptidases intracelulares dependentes de cálcio classicamente citosólicas envolvidas em diversas funções moduladores da célula, como transdução de sinais, divisão celular, apoptose e diferenciação. Embora melhor caracterizadas em mamíferos, as calpaínas já foram descritas em insetos, nematódeos, plantas, fungos, protozoários e bactérias. No Trypanosoma cruzi, como nos demais tripanossomatídeos, já foi descrita a presença de uma ampla e diversa família de calpaínas em seu genoma, mas pouco se sabe a respeito das suas funções específicas. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo buscar as sequências de calpaínas do T. cruzi em seu genoma no intuito de classificá-las, assim como avaliar a expressão gênica das sequências de maior similaridade com as calpaínas de mamíferos. Além disso, um anticorpo gerado contra uma sequência peptídica conservada entre as calpaínas selecionadas foi utilizado em ensaios de identificação, expressão e localização celular. Nesse contexto, as análises in silico identificaram ao todo 55 sequências relacionadas às calpaínas no genoma do T. cruzi. Em seguida, através de alinhamentos múltiplos e análise de domínios conservados, foi possível classificar as calpaínas em quatro grupos distintos de acordo com a presença de domínios conservados característicos desta família multigênica. Dos quatro grupos identificados, foi selecionado para aprofundamento do estudo aquele que possuía o maior número de domínios conservados e continha o domínio que alberga o sítio catalítico das calpaínas (conservado ou não)
A análise de expressão gênica de um total de dezesseis genes selecionados por qPCR revelou a presença de seis genes com expressão aumentada nas formas clinicamente relevantes (amastigotas e tripomastigotas) em relação as formas epimastigotas, e cinco genes nesta última forma. Em paralelo, o anticorpo anti-calpaínas se mostrou reativo em ensaios de Western Blotting, citometria de fluxo e microscopia de eletrônica de transmissão. Os ensaios de Western Blotting revelaram uma calpaína específica em amastigotas e outra em tripomastigotas, além de outras sete de massas moleculares variadas presentes nas três formas do parasito. Os resultados de citometria de fluxo indicam maior marcação intracelular do anticorpo nas formas amastigotas e tripomastigotas em relação aos epimastigotas. Por fim, as análises ultraestruturais revelaram a presença das calpaínas em todo citoplasma, nas membranas de vesículas, na membrana plasmática, e no flagelo das diferentes formas do parasito. O estudo comparativo da expressão das calpaínas nas formas evolutivas do T. cruzi, assim como a determinação de sua localização celular, podem ajudar a determinar as funções gerais desta família multigênica no parasito === Calpains comprise
a family of calcium dependent cy
steine peptidases
commonly
present in cytoplasm implicated in a broad range of cellular modular functions such as signal
transduction, cellular division, apoptosis and differentiation processes. Although well
-
characterized in mammals, these peptidases have
also been described in
insects, nematodes,
plants, fungi, protozoa and bacteria
.
In
Trypanosoma cruzi
, as in other trypanosomatids, the
presence of an extensive and diverse family
of
calpain
s had already been described
in its
genome
. However,
the specific
functions
of these molecules are still unclear. In this context,
the present study aimed to search calpain sequences in
T. cruzi
genome to classify the genes
and to evaluate mRNA expression levels of the most conserved calpain sequences
. In
addition, an a
ntibody against
T. cruzi
calpain was produced
from a conserved sequence of
trypanosomatid calpains to evaluate these proteases levels, also determining their
ultrastructural localization. At first,
in silico
analysis revealed a total of 55 calpain sequence
s
in
T. cruzi
genome
.
Through multiple alignments and phylogenetic analysis of conserved
domains in the
se
sequences, the calpains
were sorted
into four distinct groups characterized
by the presence of classical domains of this multigenic
family. After this
in silico
analysis, we
decided to scrutiny the group that has the highest number of conserved domains and presents
domain II, which contains the catalytic active site (either altered or conserved), in order to
analyze mRNA and protein e
xpression patterns in the different
T. cruzi
forms.
The
comparison of calpain mRNA abundance
of
sixteen
genes
by qPCR in
the three
distinct
parasite
forms revealed
six
genes with
increased
expression
in the clinical relevant
forms (amastigotes and trypomas
tigotes) and
five
in the invertebrate form. S
imultaneously
,
the anti
-
tritryp
-
calpain antibody was capable of recognizing reactive molecules in Western
Blotting, flow citometry and transmission electron microscopy analysis. Altogether, Western
Blotting anal
ysis revealed seven calpains with different molecular masses present in the three
forms of the parasite, while one specific calpain was detected either in amastigotes or
tripomastigotes. Also, flow citometry results showed a higher intracellular expression
in
amastigotes and trypomastigotes in comparison with epimastigotes. Finally, ultrastructural
analysis revealed the presence of theses proteases in the cytoplasm, vesicular membranes,
plasma membranes and flagellum of the three life cycle forms. The compa
rative study of
calpain gene expression in the distinct
T. cruzi
forms, as well as the cellular localization of
these molecules could be useful approaches to find out the calpain main functions in this
parasite.
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