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Previous issue date: 2013 === Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil === O vírus da dengue compreende quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV1-4) e até o momento não existe nenhuma vacina disponível comercialmente contra este patógeno. Alguns autores apontam a proteína NS1 de DENV como um antígeno protetor. Entretanto, ainda não se sabe ao certo o seu papel na replicação viral, bem como na indução de proteção ou patogênese. Nosso grupo vem trabalhando com as vacinas de DNA contra a dengue, testando-os em modelos murinos. Camundongos imunizados com uma vacina de DNA (pcTPANS1), que contém o gene NS1 de dengue 2 (DENV2), mostraram altos níveis de anticorpos anti-NS1 e quase 100 % de proteção quando desafiados com DENV2 (4 LD50). Este projeto tem por objetivo o mapeamento da resposta imune protetora gerada pela vacina pcTPANS1. Os resultados revelaram que 50 % dos animais que receberam o soro de outros camundongos, previamente imunizados com o plasmídeo pcTPANS1, sobreviveram à infecção após o desafio com DENV2 (4 LD50). Entretanto quando utilizamos um segundo estoque viral com 40 LD50, todos os animais apresentaram altas taxas de mortalidade e fortes sinais clínicos da infecção, com exceção do grupo de camundongos imunizados com a vacina pcTPANS1. Posteriormente analisamos o papel da resposta imune celular na proteção. O ensaio de depleção in vivo mostrou que todos os animais vacinados e depletados de células CD4+ morreram após o desafio com DENV2, enquanto que 60 % dos animais depletados de CD8+ sobreviveram à infecção. Os ensaios de transferência adotiva de células T mostraram proteção somente no grupo de camundongos que receberam concomitantemente soro e linfócitos TCD4+ provenientes de animais imunizados com a vacina pcTPANS1
As células obtidas do baço de animais vacinados com o plasmídeo pcTPANS1 foram capazes de secretar IFN-\F067 após estímulo com o peptídeo 265AGPWHLGKL273, contido na proteína NS1 de DENV2 e descrito na literatura como específico para células TCD8+\F02E\F020Também avaliamos in vivo uma possível atividade citotóxica específica para este peptídeo. Nossos resultados mostraram que os camundongos imunizados com a vacina pcTPANS1 promoveram a lise das células alvo pulsadas anteriormente com o peptídeo. Além disso, quando células alvos foram administradas 72 horas após o desafio com DENV2, houve um aumento significativo do percentual de lise. Em outro ensaio para avaliação de citotoxicidade in vivo, os animais foram imunizados com pcTPANS1 e submetidos ao tratamento para depleção de células CD4+ ou CD8+ Nossos resultados demonstraram que a atividade citotóxica específica para o peptídeo 265AGPWHLGKL273 é atribuída principalmente à população de células TCD8+, pois quando analisamos os resultados obtidos com animais imunizados e depletados de células TCD8- o percentual de lise foi reduzido para 37,9 %, corroborando os dados da literatura que descreve este peptídeo como específico para células TCD8+. Além disso, avaliamos a indução de possíveis danos gerados com a vacina pcTPANS1, tanto por análises histopatológicas do fígado quanto por dosagens dos níveis séricos de enzimas hepáticas, sem a detecção de qualquer alteração nos animais imunizados. De um modo geral, o conjunto de resultados obtidos nesse trabalho sugere que a proteção mediada pela vacina pcTPANS1 no nosso modelo experimental está relacionada principalmente com a resposta de células TCD4+ em associação com anticorpos anti-NS1, embora a vacina ative também uma resposta de células TCD8+ citotóxica === Dengue virus comprises four antigenically distinct serotypes (DENV1
-
4)
.
Nowada
ys,
there is no commercially available vaccine against this pathogen.
Some authors point
out the NS1 protein fr
om DENV as a protective antigen, h
owever, its role in viral
replication, as well as in the induction of protection or pathogenesis, remains still
unclear. Our group has been working with DNA vaccines a
gainst dengue
testing them
in murine models.
Mice immunized with one DNA vaccine (pcTPANS1), which contains
the NS1 gene from dengue 2 (DENV2), showed high levels of anti
-
NS1 antibodies and
almost 100
% protection when challenged with DENV2 (4 LD
50
). This project aims to
map the protective immune response generated by the pcTPANS1. Results showed
that 50
% of animals that received serum from other mice, previously immunized with
the pcTPANS1, survived
infection after challenge with DENV2 (4 LD
50
). However when
we used a second viral stock with 40 LD
50
, all animals showed high mortality rates and
strong clinical signs of infection, except the mouse group immunized with the
pcTPANS1 vaccine. Subsequently,
we analyzed the role of the cellular immune
response in protection. The
in vivo
depletion assay showed that all vaccinated and
depleted from CD4
+
cells died after challenge with DENV2, whereas 60
% of CD8
+
depleted animals survived infection. The assays o
f T cell adoptive transfer showed
protection only in the mouse group receiving concomitantly serum and CD4
+
T
lymphocytes recovered from animals immunized with the pcTPANS1 vaccine
.
Splenocytes obtained from pcTPANS1 vaccinated animals were able to secrete
IFN
after stimulation with the peptide
265
AGPWHLGKL
273
, present in NS1 protein
from DENV2 and described as specific for CD8 + T cells
We also analyzed
in vivo
a
possible cytotoxic activity specific for this peptide. Our results showed that mice
immuniz
ed with the pcTPANS1 vaccine promoted the lysis of target cells previously
pulsed with the peptide. Besides, when target cells were given 72 hours after challenge
with DENV2, there was a significant increase in the lysis percentage. In another assay
for th
e assessment of
in vivo
cytotoxicity, animals were immunized with pcTPANS1 and
subjected to treatment for depletion of CD4
+
or CD8
+
cells. Our results showed that
the cytotoxic activity specific for the peptide
265
AGPWHLGKL
273
is attributed mainly to
the
population of CD8
+
T cells, because when we analyzed results obtained from
animals immunized and depleted of CD8 Tcells, the lysis percentage was reduced to
37.9
%, corroborating data from literature which describes this peptide as specific for
CD8
+
T c
ells. Moreover, we evaluated the induction of possible damages generated by
the pcTPANS1 vaccine, either by histopathological analysis in the liver or by
quantification of serum levels of hepatic enzymes, without detection of any alteration in
immunized an
imals. In general, results obtained in this work suggest that protection
mediated by the pcTPANS1 vaccine in our experimental model is related mainly to the
CD4
+
T cells response in association with anti
-
NS1 antibodies, although the vaccine
also activate
s a CD8
+
T cells cytotoxic response.
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