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Previous issue date: 2010 === Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil === A automatização da Reação em Cadeia da Polimerase (PRC) abriu uma nova perspectiva no diagnóstico do Trypanossoma Cruzi tanto em amostras clínicas humanas, como na identificação do parasita em seus vetores e reservatórios. Para a realização da PCR é necessária a realização da extração do DNA (pré-etapa da amplificação), onde o ácido nucléico é liberado e purificado a partir da amostra biológica, tendo como condição ideal a obtenção de um DNA puro e em altas concentrações. Este trabalho visou avaliar o desempenho de protocolos de extração de DNA descritos na literatura científica, através dos seguintes parâmetros: concentração de DNA, grau de pureza, PCR (ampliação de uma seqüência de DNA específica), reprodutibilidade, praticidade e custo. Foram testados 12 protocolos, cujos critérios de seleção foram \201Cmétodos de extração de DNA in house de espécimes do Filo Arthropoda\201D e \201Ckits e/ou preparados comerciais mais citados na literatura científica no período de janeiro de 2002 a julho de 2009\201D. A extração foi realizada em exemplares da espécie Rhodnius brethesi infectados através de experimentos de reconstituição (infecção artificial) com 3 concentrações distintas de T. cruzi (1, 10 e 100 parasitas por amostra extraída). Os melhores resultados nos parâmetros concentração de DNA, grau de pureza e PCR, foram apresentados pelos protocolos 08 (in house) e 09 (QIAamp DNA Stool Mini Kit, Marca Qiagen, nº de cat 51504), tendo o protocolo 08 mostrado maior concentração estimada de DNA total e um maior número de amostras com valores dentro da faixa de pureza, em relação ao protocolo 09 e a todos os outros protocolos testados
Atribuímos essa melhor performance a uma associação eficiente entre número de etapas de purificação e os componentes do tampão de lise. Em relação aos parâmetros custo e praticidade, o protocolo 09 (kit) revelou ser o mais econômico e demandar menos tempo na sua execução total, comparado ao protocolo 08. Dentro do questionário de opinião, que apontou grau de pureza como parâmetro mais importante, o protocolo mais indicado para extração de amostras a partir de triatomíneos foi o protocolo 08. Assim, dois protocolos podem ser indicados: o 08 e o 09. Dos seis parâmetros analisados, os valores de estimativa de concentração de DNA, obtidos como método da espectrofotometria, apresentaram-se discrepantes; devido a isso não indicamos esse método para avaliar o parâmetro concentração. === The Polymerase Chain Reaction (PCR) enabled a new diagnosis of
Trypanosoma cruzi
in human vertebrate samples such as the parasite identification in its vectors and reservoirs.
PCR demands a pure and high concentrated DNA; therefore DNA extraction is an important
step that must be well performed. Considering this, we have evaluated specific parameters –
concentration and purity of the DNA, PCR (specific DNA sequence ampli
ficat ion),
reproducibility, practicality and cost –
in order to assess the performance of extraction
protocols. Twelve protocols were selected according to two criteria: 1
-in house methods used
to extract DNA from specimens belonging to the Phylum Arthropo
da; 2
-kits and/or
commercial preparations most often cited in scientific papers from january 2002 to july 2009.
Extraction was carried out on specimens of
Rhodnius brethesi
artificially infected with three
different concentrations of
T. cruzi
(1, 10 and 10
0 parasites per sample extracted). Protocols
08 (in house CTAB based) and 09 (QIAamp DNA Stool Mini Kit, Qiagen, Cat number
51504) revealed the best concentration and purity of the DNA results in addition to the higher
number of amplified samples. Comparat
ively, protocol 08 was even better than 09 on these
parameters, presumabily for the efficient association between number of purification steps
and components of the lysis buffer. On the other hand, protocol 09 was less costly than
protocol 08, besides fast
er to execute. Participants of a survey designated DNA purity as the
most important parameter regarding a DNA extraction protocol leading us to indicate protocol
08 for the extraction of samples taken from triatomine. Besides protocol 08, the kit
represent
ed by protocol 09 can also be indicated because of its lower cost and fastness. The
discrepancy in the results obtained for DNA concentration lead us to discourage the uso of
spectrophotometry to estimate DNA concentration
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