A heterogeneidade dos isolados silvestres de Trypanosoma Cruzi (zimodema III) expressa pelo perfil de suas glicoproteínas de superfície

• Main Author: Kikuchi, Simone Akemi
• Other Authors: Mallet, Jacenir Reis dos Santos
• Language: Portuguese
• Published: 2016
• Subjects: Trypanosoma cruzi; Glicoproteínas; Proteoma; Eletroforese em Gel Diferencial Bidimensional; Espectrometria de Massas
• Online Access: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/13078

Made available in DSpace on 2016-03-10T13:18:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 simone_kikuchi_ioc_dout_2014.pdf: 2479959 bytes, checksum: 2a905b9a047aa9c1b82436e5810d80f4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 === Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil === A doença de Chagas é uma doença tropical negligenciada que atinge principalmente a América Latina. Trypanosoma cruzi, agente etiológico desta enfermidade, é largamente distribuído no continente americano e apresenta uma grande variabilidade fenotípica e genotípica em suas cepas. Os fatores que determinam as diferentes formas clínicas da doença, assim como as razões pela qual uma cepa apresenta tropismo diferenciado não estão claros. De forma semelhante, a correlação entre a variabilidade genética do parasito, sua relação com o desenvolvimento clínico da doença, assim como sua distribuição geográfica também não está bem estabelecida. Estas observações associadas com a variabilidade na resposta ao tratamento conduzem ao fato de que este cenário complexo, possivelmente, será mais bem entendido quando houver uma completa caracterização do parasito e o entendimento da relação parasito-hospedeiro na doença de Chagas. Desta forma, com o objetivo de estudar esta diversidade, caracterizações de populações deste parasito têm sido realizadas através de técnicas biológicas, bioquímicas e moleculares tentando associar determinado grupo de parasito a um determinado perfil epidemiológico. Neste estudo, foram utilizados parâmetros moleculares e bioquímicos para caracterização de amostras de T.cruzi isolados silvestres de Triatoma vitticeps do município de Santa Maria Madalena (Rio de Janeiro) e cepas da Amazônia (Manaus e Barcelos). Estudos baseados no perfil eletroforético de isoenzimas, propuseram que o T.cruzi fosse classificado em 3 zimodemas (ZI, ZII e ZIII). Posteriormente, através de diversas técnicas de biologia molecular,classificou-se as cepas em duas grandes linhagens filogenéticas: T.cruzi I (que se correlaciona ao ZI) e T.cruzi II (que se correlaciona ao ZII) Dados ecológicos e moleculares sugerem que as cepas pertencentes ao ZIII estejam mais relacionadas a T. cruzi I do que T. cruzi II, mas na realidade a posição de ZIII permanece controversa. A diversidade encontrada entre os isolados, bem como entre estes e cepas já estabelecidas nos leva a indagações sobre as moléculas de superfície destas populações e de que forma estas poderiam influenciar na interação parasito-hospedeiro. Este trabalho tem como objetivo principal definir o mapa de proteínas solúveis das cepas e isolados pertencentes ao ZIII ressaltando as diferenças existentes. Desta forma, buscamos analisar as os mapas proteícos, perfil de proteases e estudar a expressão de glicoproteínas de superfície (Gp 82, Gp 35/50, Gp 90) destes isolados de T. cruzi (ZIII) (epimastigota e tripomastigota) obtidos de triatomíneos silvestres. Para isto foram utilizadas as técnicas de eletroforese bidimensional e espectrometria de massa. Foi feita a padronização de protocolos para a obtenção de extratos protéicos das formas epimastigotas e da separação das proteínas por eletroforese bidimensional. Os ensaios realizados na faixa de pH 3-10, revelaram uma grande diversidade de spots. Entretanto, quando a faixa de pH foi diminuida (4-7) houve um aumento no número de spots revelados. Uma diversidade considerável na expressão de proteína bem como na intensidade de vários spots também foi observada entre as cepas e isolados estudadas. Experimentos de western blot e citometria de fluxo mostraram uma expressão diferencial das gps nos diferentes isolados. Esses resultados contribuem para o conhecimento e registro do perfil de alguns isolados silvestres de T. cruzi em regiões ainda não acometidas pela doença. Nossos resultados apontaram uma heterogeneidade destes isolados de T. cruzi relacionados à biologia e expressão diferencial de enzimas de superfície === Chagas disease is a neglected tropical disease which affects mainly Latin America. Trypanosoma cruzi , the etiologic agent of Chagas disease, is widely distributed in the American continent. The factors that determine the different clinical forms of the disease, as well as the reasons why one strain shows differential tropism are not clear. Similarly, the correlation between the genetic variability of the parasite, its relationship with the clinical development of the disease, as well as their geographical distribution is also not well established. Genetical studies are important to clarify the intra - specific heterogeneity of the parasite, the study of the biological behavior and the host - parasite relationships could clarify the importance of different strains, in the determination of clinico - pathological manifestations of Chagas' disease. These observations associated with the variability in response to treatment leads to the fact that this complex scenario possibly be better understood when there is a complete characterization of the parasite and the understanding of host - parasite relationship in Chagas disease. Thus, aiming t o study aim of studying this diversity characterizations of populations of this parasite have been done by biological, biochemical and molecular techniques trying to associate certain group of a given parasite epidemiology. In this study, molecular and bio chemical parameters for the characterization of T. cruzi isolated from Triatoma vitticeps municipality of Santa Maria Madalena (Rio de Janeiro) and strains of the Amazon (Manaus and Barcelos) were used. Studies based on enzyme electrophoresis profile clust ered T.cruzi isolates into 3 zymodemes (ZI, ZII and ZIII). Molecular techniques showed a dimorphism among the isolates, grouping them into T.cruzi I (related to ZI) and T.cruzi II (related to ZII). Ecological and molecular data suggest that ZIII strains ar e more related to T. cruzi I than T. cruzi II , but their exact phylogeny is an unresolved issue. This work aims to define the map of soluble proteins of strains and isolates belonging to ZIII highlighting the differences. The diversity found among isolates , as well as between them and established strains leads to questions about the surface molecules of these populations and how these could influence the host - parasite interaction. Thus, we seek to analyze the protein maps, profile of proteases and study the expression of surface glycoproteins (Gp 82, Gp 35/50, Gp 90) of these isolates of T. cruzi (ZIII) (epimastigote and trypomastigote) obtained from silvatic triatomine s . To this end the techniques of two - dimensional electrophoresis and mass spectrometry wer e used. The present work describes the standardization of a protocol in order to obtain reproducible extraction and separation of soluble proteins using two dimensional gel electrophoresis from different ZIII strains. The experiments carried out in pH 3 - 10 , revealed a great diversity of spots . Further separation using a narrow pH range (4 - 7) showed an increase in number of spots. A considerable diversity in protein expression as well as the intensity of various spots was also observed between the strains a nd isolates studied. Experiments western blot and flow cytometry showed a differential expression of the different GPS isolated. These results contribute to the knowledge and record of some wild isolates of T. cruzi in areas not yet affected by the disease profile. Our results showed a heterogeneity of isolates of T. cruzi biology and related differential expression of enzymes surface.