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Previous issue date: 2015-10-29 === Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil === O objetivo geral do presente trabalho foi caracterizar e identificar peptidases ativas presentes nos intestinos de machos e fêmeas de Anopheles aquasalis bem como identificar as proteínas expressas no intestino e gônadas de fêmeas dessa espécie. Para a caracterização proteolítica foram usadas distintas abordagens bioquímicas que permitiram reunir um grupo importante de informações sobre a expressão de enzimas proteolíticas nesta espécie de mosquito. Usando o substrato fluorogênico Z-Phe-Arg-AMC em solução e a técnica de enzimografia por SDS-PAGE co-polimerizado com gelatina foi possível observar um perfil proteolítico composto por serina peptidases do tipo tripsina no intestino de machos e fêmeas de An. aquasalis. Estas enzimas apresentam maior atividade proteolítica na faixa de pH alcalino e ampla estabilidade térmica, sendo ativas entre 25 °C \2013 80 °C, com maior atividade entre 37 °C \2013 50 °C. Diferenças qualitativas e quantitativas na expressão das peptidases também foram detectadas. Foi observado que o perfil proteolítico difere entre macho e fêmea, sugerindo com isso que a expressão de algumas dessas enzimas é sexo-específica
Para análise proteômica do intestino e gônadas de fêmeas alimentadas com açúcar usou-se uma abordagem \201Cbottom-up\201D acoplada à análise bioinformática de dados para identificação das proteínas expressas. A análise do intestino foi feita através de um procedimento de digestão em solução sem pré-fracionamento das proteínas, ao passo que a análise das gônadas foi feita usando um protocolo de digestão em gel após fracionamento das proteínas por SDS-PAGE. Usando estas estratégias, um total de 137 e 995 proteínas foram identificadas no intestino e gônadas, respectivamente. As proteínas foram identificadas usando os programas ProLuCID e/ou PEAKS, e uma base de dados \201Ccustomizada\201D incluindo todas as sequencias de Culicídeos depositadas na base de dados UniProt (81,000 sequencias, em outubro de 2013). As identificações foram posteriormente analisadas com relação ao enriquecimento de termos de ontologia gênica e foram classificadas de acordo com seu processo biológico e função molecular, usando o módulo GeneOntology da plataforma PatternLab. A caracterização proteômica revelou para o intestino (i) a presença de várias serina peptidases do tipo tripsina, corroborando a expressão e atividade das enzimas observadas na enzimografia; (ii) a expressão de vários genes codificantes para quimiotripsina, embora a sua atividade não tenha sido detectada pela enzimografia; e para as gônadas (iii) proteínas associadas à vitelogênese; e (iv) a expressão massiva de proteínas implicadas na preparação do tecido para reprodução
Finalmente, até o presente, esta é a primeira caracterização abrangente da atividade proteolítica de machos e fêmeas de An. aquasalis bem como a primeira caracterização proteômica do intestino e gônadas de fêmeas desta espécie alimentadas com açúcar. Os resultados obtidos neste trabalho além de fornecerem informações sobre a localização tecidual de proteínas no mosquito e abrirem diversas vias de estudo da biologia e fisiologia deste vetor, contribuem também para a anotação funcional do genoma desta espécie, visto tratar-se de uma espécie com genoma ainda não concluído === The aim of this study was to characterize and identify active
peptidases
from
the midgut of males and females of
Anopheles aquasalis
and
to identify
protein
expressed in the
midgut
and gonads of females of
this species.
The
different
bioche
mical approaches used for the
proteolytic characterization
allowed
gather
ing
a group of important information about the expression of proteolytic
enzymes in
this mosquito species.
Using the fluorogenic substrate Z
-
Phe
-
Arg
-
AMC for in
-
solution enzymatic assays and by zymographic analyses (SDS
-
PAGE co
-
polymerized with gelatin) it was possible to observe a proteolytic
profile composed of trypsin
-
like serine
peptidases
in the midgut of male and
female
A
n
. aquasalis
. These
pepti
dases
exhibit high proteolytic activity at a
w
ide range of alkaline pH and
thermal stability,
being active between 25° C
-
80
° C, with more activity between 37° C
-
50° C. Qualitative and quantitative
differences in the expression of
peptidases
were also
detected. It was observed
that proteolytic profile differs between males and females, thereby suggesting
that the expression of some of these enzymes is sex
-
specific. For proteomic
analysis of the midgut and gonads of females fed on sugar
it
was used
a
"bo
ttom
-
up" proteomic approach coupled with bioinformatic
s data analysis to
identify tissue
-
specific
expressed protein
s
.
The midgut analysis was taken
through an in
-
solution digestion procedure without pre
-
fractionation of the
proteins, while the analysis of
gonads was made using an in
-
gel digestion
protocol after fractionation of proteins by SDS
-
PAGE. Using these strategies, a
total of 137 and 995 proteins were identified in the midgut and gonads,
respectively. Proteins were identified using the
ProLuCID and/
or PEAKS
software
, and a customized database including all Culicidae protein sequences
deposited at the UniProt database (81,000 sequences, in October 2013).
Protein identifications were further analyzed for the enrichment of gene ontology
terms and were c
lassified according to their biological process and molecular function using the GeneOntology module of the PatternLab platform. The
proteomic characterization
of midgut
revealed (i) the presence of various
t
rypsin
-
like serine
peptidases
,
confirming the ex
pression and activity of these
enzymes observed by zymography, (ii) the expression of several chymotrypsin
coding genes, although its activity was not detected by zymography
. Proteomics
of gonads
from female fed with sugar
revealed
(iii)
the expression of
proteins
associated with vitellogenesis and (iv) the massive expression of proteins
involved in tissue preparation for reproduction process.
F
inally, to the present
,
t
his is the first characterization of the proteolytic activity of males and females
midgut
s
of
An. aquasalis
well as
the first proteomic characterization of the
midgut and gonads of
A
n
. aquasalis
females fed with sugar.
The results
obtained in this work in addition to providing information about the cellular
localization of proteins in the mosq
uito
,
open several avenues of study of the
biology and physiology of this vector,
and
also contribute to the functional
annotation
of the genome of this species
with genome not yet completed
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