Detecção da infecção por Paracoccidioides brasiliensis por meio de PCR-ELISA e ELISA com antígenos recombinante rGp43 e sintético e reatividade à rGp43 na leishmaniose humana

• Main Author: Isabele Kazahaya Borges
• Other Authors: Mário Augusto Ono .
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental. 2016
• Online Access: http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000207183

A paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis, é uma micose sistêmica, endêmica na América Latina. O diagnóstico da PCM apresenta dificuldades como reatividade cruzada com outras micoses sistêmicas como a histoplasmose ou doenças parasitárias como a leishmaniose. Adicionalmente, PCM e leishmaniose são doenças que compartilham as mesmas áreas endêmicas. Este estudo teve como objetivos desenvolver métodos de detecção da infecção por P. brasiliensis por meio de PCR-ELISA e ELISA baseado em antígenos recombinante e sintéticos e avaliar anticorpos contra P. brasiliensis em indivíduos soropositivos e soronegativos para leishmaniose. Embora a glicoproteína 43 kDa (gp43) de P. brasiliensis seja o antígeno mais utilizado no imunodiagnóstico da PCM, podem ocorrer reações cruzadas devido principalmente a epítopos carboidrato. A gp43 recombinante produzida em Escherichia coli não é glicosilada e, portanto, pode contribuir para a redução das reações cruzadas. Os peptídeos sintéticos baseados na sequência da gp43 também constituem uma alternativa interessante, pois apresentam vantagens como baixo custo de produção, altas sensibilidade e especificidade. Amostras de soro humano positivas (n=20) e negativas (n=22) na imunodifusão com exoantígeno de P. brasiliensis foram analisadas por ELISA utilizando gp43 recombinante (rGp43) e peptídeo sintético como antígenos, respectivamente. Todas as amostras positivas na imunodifusão também foram positivas para a rGp43 enquanto 75% das amostras foram positivas no ELISA com peptídeo sintético. As amostras negativas na imunodifusão apresentaram positividade no ELISA com rGp43 e peptídeo sintético de 36,4% e 40,9%, respectivamente. Técnicas de biologia molecular também podem contribuir para o diagnóstico preciso e rápido da PCM. Uma amostra de escarro (negativa para P. brasiliensis por Nested-PCR) foi inoculada com células de P. brasiliensis diluídas em série (10 a 105 células/mL) e o DNA foi extraído e amplificado por Nested-PCR. O produto da amplificação foi analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida e por PCR-ELISA e ambas as formas de detecção permitiram a detecção de baixa quantidade de DNA, embora a PCR-ELISA tenha permitido a análise em menor tempo. Amostras de soro humano soropositivas (n=14) e soronegativas (n=39) para leishmaniose foram analisadas por ELISA e imunodifusão utilizando gp43 recombinante e exoantígeno, respectivamente. As amostras soropositivas e soronegativas para leishmaniose apresentaram positividade para rGp43 de 64,3% e 53,8%, e a diferença não foi significativa. O ELISA baseado em rGp43 e peptídeo sintético, bem como a PCR-ELISA, constituem alternativas promissoras para a detecção da infecção por P. brasiliensis. === Paracoccidioidomycosis (PCM) caused by Paracoccidioides brasiliensis is a systemic mycosis, endemic in Latin America. The diagnosis of this mycosis can be difficult due to cross reaction with other systemic fungal infections such as histoplasmosis or parasitic diseases such as leishmaniasis. In addition, PCM and leishmaniasis share the same endemic areas. The aims of this study were to develop methods for detection P. brasiliensis infection by PCR-ELISA and ELISA based on recombinant and synthetic antigens and evaluation of antibodies against P. brasiliensis in individuals seropositive and seronegative for leishmaniasis. Although the glycoprotein 43 kDa (gp43) of P. brasiliensis is a useful antigen for immunodiagnosis of PCM, cross-reaction with other antigens may occur due to carbohydrate epitopes. The use of non-glicosylated gp43 recombinant produced in Escherichia coli, can reduce cross-reactivity. Use of synthetic peptides, based in the sequence of gp43, is another interesting alternative due to low production cost, high sensitivity and specificity. Human serum samples, positive (n = 20) and negative (n = 22) for P. brasiliensis in immunodiffusion were analyzed by ELISA using recombinant gp43 (rGp43) and synthetic peptide as antigens, respectively. All the positive samples in immunodiffusion were positive by ELISA with rGp43 although 75% were positive in ELISA with synthetic peptide. Negative samples in immunodiffusion showed 36.4% positivity in ELISA with rGp43 and 40.9% in ELISA with synthetic peptide. Molecular techniques can also contribute for accurate and rapid diagnosis of PCM. A sputum sample (negative for P. brasiliensis by PCR) was inoculated with P. brasiliensis cells serially diluted in phosphate saline buffer (10 to 105 cells/ml) and the DNA was extracted and amplified by Nested-PCR. The product of the amplification was analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and PCR-ELISA and both tests detected low amounts of DNA, although analysis by PCR-ELISA was realized in shorter time. Human serum samples positive (n=14) and negative (n=39) for leishmaniasis were analyzed by ELISA and Immunodiffusion using rGp43 and P. brasiliensis exoantigen, respectively. The positive and negative serum samples for leishmaniasis showed 64.3% and 53.8% of positivity for rGp43 with no statistical significance. The ELISA based in rGp43 and synthetic peptide as well as PCR-ELISA, are promising new approaches for the detection of P. brasiliensis infection.