Anticorpo monoclonal anti-aflatoxina B1 : aplicação em imunoensaio enzimático, imunofluorescência in situ e estudo da toxicidade em embrião de frango

• Main Author: Lívia Montanheiro Médici
• Other Authors: Elisa Yoko Hirooka .
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos. 2016
• Online Access: http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000206303

O Brasil é líder mundial em exportação de carne de frango e o segundo maior produtor, a garantia da saúde e produção animal é essencial na manutenção de posição destaque perante economia nacional e mundial. As aflatoxinas (AF), metabólitos secundários produzidos por fungos do gênero Aspergillus, constituem ameaça por contaminar alimentos e rações e causar efeitos tóxicos e carcinogênicos em humanos e animais. A imunoquímica se destaca na análise de micotoxinas pela sensibilidade, confiabilidade e simplicidade, a exemplo de ensaio imunoenzimático ic-ELISA para quantificação e imunofluorescência na detecção tecidual. Com enfoque no desenvolvimento de métodos imunoquímicos, anticorpo monoclonal (AcM) antiaflatoxina foi produzido in vitro, cultivando hibridoma linhagem AF4 em meio RPMI + 50% de soro fetal bovino (SFB), seguido de adaptação gradual ao meio H-SFM, obtendo-se total de 508,6 mg de anticorpo purificado. O AcM diluído ao título de 1:10.000 permitiu quantificação de AFB1 em fígado de frango por ic-ELISA. Na validação intralaboratorial do ic-ELISA, a interferência de matriz não contaminada (fígado), foi avaliada no fator de diluição entre 2 a 15, sendo a diluição 5x escolhida pelo menor CV (14%) e melhor recuperação (100%). Em seguida, as curvas padrão na ausência e presença da matriz foram comparadas pela porcentagem de ligação de cinco pontos (0,05 ng/mL a 5,0 ng/mL), não obtendo diferença significativa (p > 0,05). A curva padrão de AFB1 demonstrou linearidade adequada, expressa pela equação de regressão y = -13.34 ln(x) + 50.352 e R2 de 0,9917 (p < 0.05). As taxas de recuperação foram 90,5; 91,3 e 81,3% para 1,5; 3,0 e 5,0 ng/g, respectivamente. A precisão do método foi avaliada por repetibilidade (CV de 3,8; 4,6 e 4,0% para 1,5; 3,0 e 5,0 ng/g) e precisão intermediária (CV de 4,7; 7,0 e 5,0% para 1,5; 3,0 e 5,0 ng/g), estando todos os valores dentro dos limites preconizados pelas agências reguladoras. A robustez foi avaliada pela troca de analistas, instrumento (micropipeta) e tempo de sensibilização (18 e 24 h) da placa; o CV foi de 4 a 8% para sete curvas padrão realizadas por analistas diferentes, o CV médio obtido pela troca de instrumento e tempo de sensibilização foi de 5,2%, garantindo robustez para as três variáveis testadas. O limite de detecção foi de 1,2 ng/g e limite de quantificação de 1,5 ng/g. O AcM, ao título de 1:100, foi também aplicado na detecção direta de AFB1 em tecido hepático de embrião de frango por imunohistoquímica colorimética (DAB-diaminobenzidina) e imunofluorescência (FICT-Fluorescein Isothiocyanate). Análise macroscópica, histológica e imuno-histoquímica foram conduzidas em quatro grupos experimentais, sendo G1: sem tratamento; G2: controle negativo da solução veículo (50% DMSO: 50% H2O); G3: 50 ng AFB1/ovo e G4: 1 &#956;g AFB1/ovo, injetados via saco de gema. Após 24 h de exposição, os embriões foram eutanaziados para análise (taxa de sobrevivência de 85,7%; 42,9%; 28,6% e 0% para os grupos G1, G2, G3 e G4, respectivamente). Não houve diferença significativa no tamanho dos órgãos entre os grupos (p > 0,05). As lesões macroscópicas evidentes nos grupos tratados com AFB1 foram hemorragia no coração (42,9% no G4; 28,6% no G3; 14,3% no G2 e sem observações no G1) e pulmão (57,1% no G4; 42,9% no G3 e sem observações no G2 e G1). Fígado e rins hemorrágicos foram evidenciados com maior frequência nos grupos tratados e controle (71,4% no G4 e G3; 42,9% no G2 e 14,3% no G1, para fígado; e 57,1% no G4, G3 e G2 e 14,3% no G1, para rim), visto que o veículo DMSO também apresentou toxidez contra os embriões. Órgãos friáveis, que caracterizam os primeiros sinais de aflatoxicose, foram evidenciados no G4 (57,1%) e G3 (42,8%), mas não nos grupos controle. Na análise 7 histológica, não houve diferença significativa no escore lesional total hepático entre os grupos G2, G3 e G4 (escore de 13,9; 14,1 e 16,3, respectivamente; p > 0,05), mas estes grupos diferiram em relação ao G1 (escore de 3,1; p < 0,05). A presença de dissociação dos hepatócitos, necrose e inflamação aleatória foram expressivas nos grupos tratados com AFB1 e DMSO, não sendo detectadas no G1. Na imuno-histoquímica, ambas as técnicas colorimétrica e fluorescente foram capazes de detectar AFB1 no tecido, sendo que a imunofluorescência permitiu a visualização definida da marcação da toxina nos hepatócitos, se comparada à colorimétrica, que marcou toda a extenção dos hepatócitos com deposição do DAB. A produção ilimitada de AcM permitiu desenvolver imunoensaio ic-ELISA com custo 160 vezes inferior aos kits comerciais, assim como permitiu a detecção direta de toxina no tecido, mostrando-se promissor para triagem de AFB1 em fígado de frango e no diagnóstico de aflatoxicoses. === Brazil is the world's leading exporter of chicken meat and second main producer, ensuring animal health and production is essential to maintain this leading position in the national and world economy. Aflatoxins (AF), secondary metabolites produced by fungi of the genus Aspergillus, are a threat in order to contaminate food and feed and cause toxic and carcinogenic effects in humans and animals. Immunochemistry stands out in the analyses of mycotoxins, due to its sensitivity, reliability and simplicity, as ic-ELISA immunoassay to quantify and immunofluorescence for detection in tissue. Focusing on development of immunochemical methods, monoclonal antibody (mAb) anti-aflatoxin was produced in vitro, by the cultivation of hybridoma lineage AF4 in RPMI medium + 50% fetal bovine serum (FBS), followed by gradual adaptation to the H-SFM medium, resulting in a total of 508.6 mg of purified antibody. The MAb diluted to a titer of 1: 10,000 allowed quantitation of AFB1 in chicken liver by ic-ELISA. Intralaboratorial validation of ic-ELISA was carried out by analysis of interference of uncontaminated matrix (liver), in a diluton factor from 2 to 15, the dilution 5x was selected because of the lowest CV (14%) and better recovery (100%). Then, the standard curves in the absence and presence of the matrix were compared by the percentage of binding of five points (0.05 ng/mL to 5.0 ng/mL), there was no significant difference between them (p > 0,05). The AFB1 standard curve showed adequate linearity, expressed by regression equation y = -13.34 ln(x) + 50.352 and R2 equal to 0.9917 (p < 0.05). The recovery rates were 90.5; 91.3 and 81.3% for 1.5; 3.0 and 5.0 ng/g, respectively. Precision was evaluated by repeatability (CV of 3.8; 4.6 and 4.0% for 1.5; 3.0 and 5.0 ng/g), and intermediate precision (CV of 4.7; 7.0 and 5.0% for 1.5; 3.0 and 5.0 ng/g), the values found in this work are within the limits recommended by regulatory agencies. The robustness was evaluated by exchanging analysts, instrument (micropipette) and coating time (18 and 24 hours); CV ranged from 4 to 8% for seven curves performed by different analysts, the mean value of CV obtained by the exchange of instrument and coating time was 5.2%, ensuring robustness for the three variables tested. Limit of detection was 1.2 ng/g, and limit of quantitation was 1.5 ng/g. Mab was also applied for direct detection of AFB1 in liver tissue of chicken embryo, at a titer of 1: 100, by colorimetric immunohistochemistry (DABdiaminobenzidine) and immunofluorescence (FITC-Fluorescein Isothiocyanate). Macroscopic, histological and immunohistochemical analysis were conducted in four groups, defined as: G1: no treatment; G2: negative control of vehicle solution (50% DMSO: 50% H2O); G3: 50 ng AFB1/egg and G4: 1 &#956;g AFB1/egg, injected via yolk sac. After 24 hours of exposure, the embryos were sacrificed for analysis, the survival rate was 85.7%; 42.9%; 28.6% and 0% for the groups G1, G2, G3 and G4, respectively. There was no significant difference in the size of organs between the groups (p > 0.05). The evident macroscopic lesions in the groups treated with AFB1 were heart hemorrhage (42.9% in G4, 28.6% in G3, 14.3% in group 2 and no observations in G1) and lung hemorrhage (57.1% in G4, 42.9% in G3 and no observations in G2 and G1). Hemorrhage in liver and kidney were evidenced more frequently in treated and control groups (71.4% in G4 and G3, 42.9% in G2 and 14.3% in G1, for liver; and 57.1% in G4, G3 and G2 and 14.3% in G1, for kidney), since dimethylsulfoxide (DMSO), used as a vehicle solution, also showed toxicity against embryos. Friable organs, that characterize the first aflatoxicosis signals, were observed in the G4 (57.1%) and G3 (42.8%), and not observed in control groups. At the histological analysis, there was no 9 significant difference in total lesion score of the liver between G2, G3 and G4 (score of 13.9, 14.1 and 16.3, respectively; p > 0.05), but there was difference of these groups compared to G1 (score 3.1; p < 0.05). The presence of dissociation of hepatocytes, necrosis and inflammation areas were expressive in the groups treated with AFB1 and DMSO, not being detected in G1. In immunohistochemistry, both colorimetric and fluorescent techniques were able to detect AFB1 in tissue, immunofluorescence allowed defined visualization of the toxin in hepatocytes, compared to colorimetric, that has marked the whole extension of hepatocytes by deposition of DAB. The unlimited production of mAb allowed the development of immunoassay ic-ELISA with cost around 160 times lower than commercial kits, and allowed the direct detection of toxin in tissue, proving to be promising in the application for AFB1 screening in chicken liver and diagnosis of aflatoxicosis.