Efeito da adição de EGF ou FSH no cultivo in vitro de folículos pré-antrais equinos inclusos em fragmentos ovarianos

O objetivo do presente trabalho foi testar a adição de diferentes concentrações de FSH ou EGF ao meio de cultivo in vitro por 2 ou 6 dias sobre o desenvolvimento de folículos pré-antrais inclusos em fragmentos ovarianos equinos. Para tanto foram realizados dois experimentos. No primeiro foram testad...

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Main Author: Marilu Constantino Max
Other Authors: Marcelo Marcondes Seneda .
Language:Portuguese
Published: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. 2016
Online Access:http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000204846
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description O objetivo do presente trabalho foi testar a adição de diferentes concentrações de FSH ou EGF ao meio de cultivo in vitro por 2 ou 6 dias sobre o desenvolvimento de folículos pré-antrais inclusos em fragmentos ovarianos equinos. Para tanto foram realizados dois experimentos. No primeiro foram testadas diferentes concentrações de EGF (10, 50, 100 e 200 ng/mL) adicionadas ao meio de cultivo in vitro durante 2 dias. Já o segundo utilizou concentrações de FSH (10, 50, 100 e 200 ng/mL) por 2 ou 6 dias de cultivo. O protocolo a seguir foi o mesmo para os dois experimentos, diferenciando apenas as moléculas (EGF ou FSH) testadas. Ovários (n=5) de éguas em anestro sazonal foram coletados em abatedouro local. Fragmentos (n=6 EGF; n=11 FSH) de tecido ovariano com aproximadamente 3x3x1 mm foram obtidos de cada animal. Um fragmento foi imediatamente fixado e processado para análise histológica (grupo controle; Dia 0), o restante dos fragmentos foram colocados em PBS suplementado com penicilina (200 UI/mL) e estreptomicina (200 mg/mL) a 4° C durante 1 hora (período de transporte até o laboratório). Os fragmentos foram cultivados in situ durante 2 dias (D2) ou 6 dias (D6) em MEM+ ou MEM+ acrescido de concentrações diferentes de FSH ou EGF, criando os seguintes grupos para cada experimento: controle (D0); MEM+ (D2); MEM+ (D6); MEM+ 10 ng/mL FSH ou EGF (D2); MEM+ 10 ng/mL de FSH (D6); MEM+ 50 ng/mL de FSH ou EGF (D2); MEM+ 50 ng/mL de FSH (D6); MEM+ 100 ng/mL de FSH ou EGF (D2); MEM+100 ng/mL de FSH (D6); MEM+ 200 ng/mL de FSH ou EGF (D2); e MEM+ 200 ng/mL de FSH (D6). Os folículos pré-antrais foram avaliados por microscopia óptica e classificados de acordo com a fase de desenvolvimento (primordial, e em desenvolvimento) e a sua morfologia (normal ou degenerado). O modelo estatístico utilizado foi Teste Exato de Fisher (p<0,05). No total foram avaliadas 1637 lâminas contendo 5818 cortes histológicos. Somente 13,85% dos cortes avaliados apresentavam folículos estando estes em diferentes fases de desenvolvimento. No primeiro experimento, após 2 dias de cultivo, os grupos cultivados com 200 ng/mL de FSH, tal como a concentração 10 ng/mL no cultivo por 6 dias apresentaram as melhores taxas de folículos em desenvolvimento comparando-os aos demais tratamentos. Em relação à integridade, os folículos pré-antrais na concentração de 100 ng/mL de FSH no cultivo por 2 dias e as concentrações de 50, 100 e 200 ng/mL de FSH no cultivo por 6 dias mostraram resultados superiores em relação ao restante dos grupos. No segundo experimento, por dois dias de cultivo, as concentrações 10, 100 e 200 ng/mL de EGF proporcionaram melhores taxas de desenvolvimento folicular em comparação com os demais tratamentos (controle D0, 50 e MEM+). Ao avaliar as taxas de folículos totais íntegros os tratamentos com 100 e 200 ng/mL de EGF obtiveram melhores resultados. Desta maneira concluímos que a adição de FSH por 2 ou 6 dias ou EGF por 2 dias ao meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais equinos foram eficientes em promover o desenvolvimento e manter integridade folicular. === The aim of this study was to evaluate the addition of different concentrations of FSH or EGF in equine preantral follicles through in vitro culture. Therefore, we conducted two experiments. The first one was conducted to test different concentrations of EGF (10, 50, 100 and 200 ng / mL) added to the medium in vitro culture for 2. In the second one we used concentrations of FSH (10, 50, 100 and 200 ng / mL) for 2 or 6 days of culture. The standard protocol for both, except the inclusion of EGF or FSH, was as follows. Ovaries (n = 5) from mares in seasonal anestrus were collected at a local slaughterhouse. Ovarian tissue fragments (EGF n=6; FSH n = 11) of about 3x3x1 mm were obtained from each ovary. One fragment was immediately fixed and processed for histological analysis (non cultured control, Day 0)- and, the remaining fragments were placed in PBS supplemented with penicillin (200 IU / mL) and streptomycin (200 mg / mL) at 4 ° C for 1 hour (period of transport to the laboratory). The fragments were cultured for 2 days in situ (D2) or 6 days (D6) in MEM or MEM+ plus different concentrations of FSH or EGF, creating the following groups for each experiment: control (D0); MEM + (D2); MEM + (D6); MEM + 10 ng / mL EGF and FSH (D2); MEM + 10 ng / mL of FSH (D6); MEM + 50 ng / mL of FSH or EGF (D2); MEM + 50 ng / mL of FSH (D6); MEM + 100 ng / mL FSH and EGF (D2); MEM + 100 ng / mL of FSH (D6); MEM + 200 ng / mL FSH and EGF (D2); and MEM + 200 ng / mL of FSH (D6). Preantral follicles were evaluated by histology and classified according to the developmental stage (primary and developing) and morphology (normal or degenerated). The statistical model used was Fisher?s Exact Test (p<0.05). At total of 1,637 slides were evaluated, containing 5,818 tissue sections. Only 13.8% of the evaluated sections presented follicles, which were at different stages of development. The first experiment, after 2 days of culture, samples cultured with 200 ng / mL FSH showed the best follicle development rates compared to the other treatments, while after six days the best results were found with10 ng / mL FSH. Regarding the integrity of preantral follicles, the group exposed to 100 ng / mL FSH for for 2 days and 50, 100 and 200 ng / mL FSH for 6 days showed better results in comparison relation to the other groups. The second one, for two days of culture, concentrations 10, 100 and 200 ng / mL EGF provided the best developmental rates of follicles, when compared to the other treatments (D0 control 50 and MEM). We conclude that FSH for 2 or 6 days or EGF for 2 days added to the medium in vitro culture were effective in promoting follicular development in equine ovarian fragments.
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Fragmentos (n=6 EGF; n=11 FSH) de tecido ovariano com aproximadamente 3x3x1 mm foram obtidos de cada animal. Um fragmento foi imediatamente fixado e processado para análise histológica (grupo controle; Dia 0), o restante dos fragmentos foram colocados em PBS suplementado com penicilina (200 UI/mL) e estreptomicina (200 mg/mL) a 4° C durante 1 hora (período de transporte até o laboratório). Os fragmentos foram cultivados in situ durante 2 dias (D2) ou 6 dias (D6) em MEM+ ou MEM+ acrescido de concentrações diferentes de FSH ou EGF, criando os seguintes grupos para cada experimento: controle (D0); MEM+ (D2); MEM+ (D6); MEM+ 10 ng/mL FSH ou EGF (D2); MEM+ 10 ng/mL de FSH (D6); MEM+ 50 ng/mL de FSH ou EGF (D2); MEM+ 50 ng/mL de FSH (D6); MEM+ 100 ng/mL de FSH ou EGF (D2); MEM+100 ng/mL de FSH (D6); MEM+ 200 ng/mL de FSH ou EGF (D2); e MEM+ 200 ng/mL de FSH (D6). Os folículos pré-antrais foram avaliados por microscopia óptica e classificados de acordo com a fase de desenvolvimento (primordial, e em desenvolvimento) e a sua morfologia (normal ou degenerado). O modelo estatístico utilizado foi Teste Exato de Fisher (p<0,05). No total foram avaliadas 1637 lâminas contendo 5818 cortes histológicos. Somente 13,85% dos cortes avaliados apresentavam folículos estando estes em diferentes fases de desenvolvimento. No primeiro experimento, após 2 dias de cultivo, os grupos cultivados com 200 ng/mL de FSH, tal como a concentração 10 ng/mL no cultivo por 6 dias apresentaram as melhores taxas de folículos em desenvolvimento comparando-os aos demais tratamentos. Em relação à integridade, os folículos pré-antrais na concentração de 100 ng/mL de FSH no cultivo por 2 dias e as concentrações de 50, 100 e 200 ng/mL de FSH no cultivo por 6 dias mostraram resultados superiores em relação ao restante dos grupos. No segundo experimento, por dois dias de cultivo, as concentrações 10, 100 e 200 ng/mL de EGF proporcionaram melhores taxas de desenvolvimento folicular em comparação com os demais tratamentos (controle D0, 50 e MEM+). Ao avaliar as taxas de folículos totais íntegros os tratamentos com 100 e 200 ng/mL de EGF obtiveram melhores resultados. Desta maneira concluímos que a adição de FSH por 2 ou 6 dias ou EGF por 2 dias ao meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais equinos foram eficientes em promover o desenvolvimento e manter integridade folicular. The aim of this study was to evaluate the addition of different concentrations of FSH or EGF in equine preantral follicles through in vitro culture. Therefore, we conducted two experiments. The first one was conducted to test different concentrations of EGF (10, 50, 100 and 200 ng / mL) added to the medium in vitro culture for 2. In the second one we used concentrations of FSH (10, 50, 100 and 200 ng / mL) for 2 or 6 days of culture. The standard protocol for both, except the inclusion of EGF or FSH, was as follows. Ovaries (n = 5) from mares in seasonal anestrus were collected at a local slaughterhouse. Ovarian tissue fragments (EGF n=6; FSH n = 11) of about 3x3x1 mm were obtained from each ovary. One fragment was immediately fixed and processed for histological analysis (non cultured control, Day 0)- and, the remaining fragments were placed in PBS supplemented with penicillin (200 IU / mL) and streptomycin (200 mg / mL) at 4 ° C for 1 hour (period of transport to the laboratory). The fragments were cultured for 2 days in situ (D2) or 6 days (D6) in MEM or MEM+ plus different concentrations of FSH or EGF, creating the following groups for each experiment: control (D0); MEM + (D2); MEM + (D6); MEM + 10 ng / mL EGF and FSH (D2); MEM + 10 ng / mL of FSH (D6); MEM + 50 ng / mL of FSH or EGF (D2); MEM + 50 ng / mL of FSH (D6); MEM + 100 ng / mL FSH and EGF (D2); MEM + 100 ng / mL of FSH (D6); MEM + 200 ng / mL FSH and EGF (D2); and MEM + 200 ng / mL of FSH (D6). Preantral follicles were evaluated by histology and classified according to the developmental stage (primary and developing) and morphology (normal or degenerated). The statistical model used was Fisher?s Exact Test (p<0.05). At total of 1,637 slides were evaluated, containing 5,818 tissue sections. Only 13.8% of the evaluated sections presented follicles, which were at different stages of development. The first experiment, after 2 days of culture, samples cultured with 200 ng / mL FSH showed the best follicle development rates compared to the other treatments, while after six days the best results were found with10 ng / mL FSH. Regarding the integrity of preantral follicles, the group exposed to 100 ng / mL FSH for for 2 days and 50, 100 and 200 ng / mL FSH for 6 days showed better results in comparison relation to the other groups. The second one, for two days of culture, concentrations 10, 100 and 200 ng / mL EGF provided the best developmental rates of follicles, when compared to the other treatments (D0 control 50 and MEM). We conclude that FSH for 2 or 6 days or EGF for 2 days added to the medium in vitro culture were effective in promoting follicular development in equine ovarian fragments. 2016-02-04 info:eu-repo/semantics/publishedVersion info:eu-repo/semantics/doctoralThesis http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000204846 por info:eu-repo/semantics/openAccess Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. URL BR reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEL instname:Universidade Estadual de Londrina instacron:UEL