| Summary: | O câncer de mama é o segundo tipo de neoplasia mais frequente entre as mulheres no mundo todo. A metformina é uma droga antihiperglicemiante segura e eficaz, amplamente utilizada no tratamento do diabetes tipo 2. Nos últimos anos, o seu uso tem sido associado a menor incidência de câncer e, por esses motivos, os seus efeitos na proliferação de células de câncer de mama e na sensibilização dessas células ao tratamento têm sido investigados. Pesquisas recentes demonstram que a metformina reduz a proliferação de células de câncer de mama sensíveis e é capaz de ressensibilizar células com múltipla resistência a drogas. Entretanto, os mecanismos de ação da metformina ainda não foram totalmente esclarecidos, e a sua capacidade de sensibilizar as células tumorais ao tratamento nunca foi descrita. Portanto, o objetivo desse trabalho foi investigar a participação do estresse oxidativo (EO) nos mecanismos de citotoxicidade da metformina em células de adenocarcinoma mamário humano positivas para receptores hormonais e triplo negativas, MCF-7 e MDA-MB- 231, respectivamente, e investigar os efeitos da metformina no processo de indução experimental de resistência à doxorrubicina. Para a análise da participação do EO nos mecanismos de citotoxicidade da droga, avaliou-se o padrão de morte celular, a presença de danos oxidativo ao DNA, parâmetros de estresse oxidativo e efeito da metformina sobre algumas proteínas de sinalização importantes no controle do crescimento e proliferação celular (ERK1/2, AKT, TGF − β1 e p53). Para isso, quatro concentrações diferentes da droga foram utilizadas: duas clinicamente relevantes, que correspondem às concentrações plasmáticas encontradas em indivíduos após tratamento (6 e 30 μM), e duas experimentais (1000 e 5000 μM). Para a investigação dos efeitos da metformina no processo de indução de resistência à doxorrubicina, as células foram expostas a concentrações crescentes do quimioterápico e a metformina foi associada em diferentes momentos, simultaneamente e através de um prétratamento. Foram analisados o estado oxidativo celular ao longo do processo de indução da quimiorresistência, os níveis de óxido nítrico (NO) e os efeitos da droga em vias que poderiam relacionar-se com a quimiorresistência, como a p53, NF-kB, Nrf2 e TGF-β1. Com base nos primeiros resultados (em células sensíveis), escolhemos uma concentração de metformina que identificamos como não citotóxica (6 μM) para ser estudada no modelo de indução de resistência à doxorrubicina. Os resultados demonstraram que a metformina, nas células de câncer de mama sensíveis, é citotóxica a partir de concentrações clinicamente relevantes (30 μM) e que esse efeito ocorre através da indução simultânea de estresse oxidativo, dano de DNA e aumento dos níveis citoplasmáticos de TGF-β1. Além disso, a droga, em concentrações mais elevadas (1000 e 5000 μM), induz apoptose celular, diminui a ERK1/2 e a Akt (5000 μM), e aumenta os níveis nucleares de p53 (1000 e 5000 μM). No processo de indução de quimiorresistência, o pré-tratamento com metformina preveniu a resistência à doxorrubicina nas duas linhagens celulares estudadas, além de sensibilizar as células MCF-7 ao quimioterápico. Essa prevenção ocorreu através da geração de estresse oxidativo, redução nos níveis de NO, aumento de p53 nuclear e de TGF-β1 citoplasmático, e redução de Nrf2 nuclear. Esses resultados ajudam a entender os mecanismos de ação da metformina em células MCF-7 e MDA-MB-231 e sugerem que o tratamento com a droga pode exercer efeito benéfico na prevenção da resistência à doxorrubicina, ressaltando a potencial utilidade clínica da metformina como adjuvante na terapia do câncer de mama. === Breast cancer is the second type of the most frequent neoplasia among women worldwide. Metformin is a safe and effective anti-hyperglycemic drug widely used in the treatment of type 2 diabetes. In the last years, its use has been associated with a lower cancer incidence and, for these reasons, their effects on breast cancer cells proliferation and in the sensitization of these cells to treatment have been investigated. Current research demonstrated that metformin reduces proliferation of breast cancer cells and sensitize multidrug resistance cells. However, the metformin mechanisms of action has not yet been fully elucidated, and its interference with the process of chemoresistance induction has never been described. Therefore, the objective of this study was to investigate the involvement of oxidative stress (OS) in the mechanism of metformin cytotoxicity in human mammary adenocarcinoma cells positive for hormone receptors and triple negative, MCF-7 and MDA-MB-231, respectively, and investigate the metformin effects in the process of experimental doxorubicin resistance induction. For the analysis of the participation of OS in the mechanisms of drug cytotoxicity, it was evaluated the cell death pattern, the presence of oxidative DNA lesions, oxidative stress parameters and the drug effect on some important signaling proteins involved in the control of cell growth and proliferation, such as ERK1/2, AKT, TGF - β1 and p53. Four different concentrations of metformin were used: two clinically relevant, corresponding to plasmatic concentrations found in patients after diabetes treatment (6 e 30 μM), and two experimental (1000 and 5000 μM). For the investigation of metformin participation in the process of chemoresistance induction, the cells were exposed to increasing concentrations of the chemotherapic and metformin was associated at different times, simultaneously and through a pretreatment. It was evaluated the cellular oxidative status during the process of chemoresistance induction, the nitric oxide (NO) levels and the drug effects on pathways that could be related to chemoresistance, such as p53, NF-kB, Nrf2 and TGF-β1. Based on the first results (in sensitive cells), we chose a non-cytotoxic metformin concentration (6 μM) to be studied in the model of doxorubicin resistance induction. The results demonstrated that metformin is cytotoxic to tumor cells from clinically relevant concentrations (30 μM) and that this effect occurs by the simultaneous induction of oxidative stress, DNA damage and increase in cytoplasmic TGF-β1. In addition, at higher concentrations, the drug induces apoptosis (1000 and 5000 μM), reduces the ERK1 / 2 and Akt (5000 μM), and increases nuclear p53 (1000 and 5000 μM). In the process of chemoresistance induction, metformin pretreatment prevented the doxorubicin resistance in both cell lines, as well as sensitize MCF-7 cells to chemotherapy. This prevention occurred by the generation of oxidative stress, reduction in the NO levels, increases in nuclear p53 and cytoplasmic TGF-β1, and reduction of nuclear Nrf2. These findings helps to understand the metformin mechanism of action on MCF-7 and in MDA-MB-231 breast cancer cells and suggests that metformin treatment could exert a beneficial role in the prevention of doxorubicin chemoresistance, highlighting the potential clinical utility of metformin as adjuvant during breast cancer treatment.
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