Efeito da adição de antioxidantes no cultivo in vitro de folículos pré-antrais equinos inclusos em fragmentos ovarianos

• Main Author: Roberta Garbelini Gomes
• Other Authors: Marcelo Marcondes Seneda .
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. 2015
• Online Access: http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000198987

O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos da adição dos antioxidantes ácido ascórbico ou ácido alfa lipoico no cultivo in vitro de foliculos pré-antrais equinos inclusos em fragmentos ovarianos, por 2 ou 6 dias. Em cada um dos experimentos, foram coletados 5 ovários (n = 5) oriundos de 5 éguas em anestro estacional de abatedouro local. Os fragmentos ovarianos (experimento 1: ácido ascórbico) e os ovários (experimento 2: ácido alfa lipoico) foram transportados em PBS suplementado com estreptomicina (200 mg/mL) e penicilina (200 UI/mL) a 4º C por uma hora. Os fragmentos (n = 9) obtidos da porção mais interna do tecido ovariano de cada animal pesavam 125 a 135 mg, medindo 5 x 5 x 1 mm. Um dos fragmentos foi imediatamente fixado em Bouin (Controle; MEM-D0) e os outros fragmentos foram cultivados por 2 (D2) ou 6 dias (D6) em MEM suplementado (MEM+) ou MEM+ acrescido de 3 diferentes concentrações de ácido ascórbico (25, 50 ou 100 &#956;g/mL) ou ácido alfa lipoico (50, 100 ou 250 &#956;M). Ao término do cultivo in vitro, todos os fragmentos obtidos foram submetidos à avaliação histológica através de coloração de PAS. Os fragmentos obtidos no experimento 2 também foram submetidos à avaliação da atividade proliferativa das células da granulosa através de imunohistoquímica utilizando o marcador antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA). Todos os folículos pré-antrais encontrados foram classificados de acordo com seu estágio de desenvolvimento em primordial ou em desenvolvimento (primário e secundário) e também quanto à sua morfologia, em normal ou degenerado. Para a imunohistoquímica, os folículos também foram classificados em PCNA-positivo (pelo menos uma célula da granulosa corada) e PCNA-negativo (nenhuma coloração). Os dados obtidos no experimento 1, foram analisados através do teste de Kruskal-Wallis e no experimento 2, através do teste Exato de Fisher, ambos com nível de significância de 5% (p < 0,05). No experimento 1, foram analisados 407 folículos e 43,5% apresentaram-se morfologicamente normais. Os tratamentos MEM+, 25, 50 e 100 &#956;g/mL no dia 2 de cultivo in vitro apresentaram resultados similares quanto à porcentagem de folículos em desenvolvimento. Os tratamentos MEM+ adicionado de 50 ou 100 &#956;g/mL de ácido ascórbico apresentaram maiores porcentagens de folículos em desenvolvimento que primordiais comparado aos demais grupos testados no dia 6 de cultivo in vitro (p < 0,05). No experimento 2, foram analisados 1095 folículos (767 folículos através de histologia e 328 através de imunohistoquímica). Dos 767 folículos analisados através de histologia, 56,3% apresentaram-se morfologicamente normais. O grupo MEM+ apresentou maior porcentagem de folículos em desenvolvimento (88,2%) que primordiais, diferindo dos demais grupos no dia 2 de cultivo in vitro (p < 0,05). O grupo MEM+ acrescido de 50 &#956;M de ácido alfa lipoico, mostrou melhores resultados comparado aos demais tratamentos no dia 6 do cultivo in vitro (p < 0,05), com 100% dos folículos em desenvolvimento e PCNA-positivo. Pode-se concluir que o cultivo por 6 dias de folículos pré-antrais equinos inclusos em fragmentos ovarianos oriundos de abatedouro em MEM+ acrescido de 50 ou 100 &#956;g/mL de ácido ascórbico ou MEM+ acrescido de 50 &#956;M de ácido alfa lipoico, permitiu o desenvolvimento folicular. === The aim of this study was to evaluate the effects of the addition of the antioxidants ascorbic acid or alpha lipoic acid on in vitro culture of equine preantral follicles enclosed in ovarian fragments, for 2 or 6 days. In each experiment, 5 ovaries (n = 5) of 5 mares in seasonal anestrus were collected from a local slaughterhouse. The ovarian fragments (experiment 1: ascorbic acid) and ovaries (experiment 2: alpha lipoic acid) were transported in PBS supplemented with streptomycin (200 mg/mL) and penicillin (200 IU/mL) at 4 °C during one hour. The inner portion of ovarian tissue fragments’ (n= 9) measurements indicate weights between the range of 125 to 135 mg in dimensions of 5 x 5 x 1 mm. One fragment was immediately fixed in Bouin (control; MEM-D0) and the other fragments were cultured for 2 (D2) or 6 days (D6) in MEM supplemented (MEM+) or MEM+ with the addiction of 3 different ascorbic acid concentrations (25, 50, or 100 &#956;g/mL) or alpha lipoic acid (50, 100, or 250 &#956;M). At the end of the in vitro culture, all fragments were subjected to histological evaluation by PAS staining. The fragments obtained in experiment 2 were also evaluated for proliferative activity of granulosa cells by immunohistochemistry with the use of proliferation cell nuclear antigen (PCNA). All preantral follicles were categorized according the stage of development in primordial or development (primary and secondary), and also according the morphology, in normal or degenerated. By immunohistochemistry, the follicles were classified in PCNA-positive (at least one granulosa cell and/or oocyte staining) and PCNA-negative (no staining). The analysis of the data obtained in experiment 1 was made using the Kruskal-Wallis test, while experiment 2 was made using Fisher's exact test, both of them with a significance level of 5% (P < 0.05). In experiment 1, 407 follicles were analyzed and 43.5% were categorized as morphologically normal. The treatments MEM+, 25, 50 and 100 &#956;g/mL on day 2 resulted in similar percentages of developing follicles. The MEM+ treatment containing 50 or 100 &#956;g/mL ascorbic acid presented higher percentages of developing follicles than primordial in comparison to the other in vitro culture groups tested on day 6 (P < 0.05). In experiment 2, 1095 follicles were analyzed (767 follicles by histology and 328 by immunohistochemistry). In 767 follicles analyzed by histology, 56.3% were morphologically normal. The MEM+ group had a higher percentage of developing follicles (88.2%) than primordial, differing from the other in vitro culture groups on day 2 (P < 0.05). The MEM+ group plus 50 &#956;M of alpha lipoic acid presented better results when compared to the other in vitro culture treatments on day 6 (P < 0.05), with 100% of the development follicles and PCNA-positive. In conclusion, follicular development was observed after in vitro culture of equine preantral follicles enclosed in ovarian fragments collected in abattoir during 6 days in MEM+ plus 50 or 100 &#956;g/mL ascorbic acid or MEM+ plus 50 &#956;M of alpha lipoic acid.