Participação da IL-33 em modelos de resposta inflamatória inata e dor neuropática em camundongos

• Main Author: Ana Carla Zarpelon
• Other Authors: Waldiceu Aparecido Verri Júnior .
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental. 2013
• Online Access: http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000192607

A IL-33 é um membro da família de citocinas IL-1, que sinaliza via receptor ST2. Essa citocina está envolvida na dor induzida pela resposta imune adaptativa, entretanto, pouco se sabe a respeito do papel da IL-33 em modelos de resposta imune inata e dor neuropática. Nesse trabalho demonstramos os mecanismos pelos quais a IL-33 contribui para inflamação inata induzida pela carragenina. Além disso, foi investigado o papel da IL-33 em modelo de neuropatia induzido pela injúria por constrição crônica do nervo ciático em camundongos. No primeiro momento, avaliamos se a carragenina e a IL-33 eram capazes de induzir a resposta inflamatória em animais BALB/c (selvagem) e deficientes para o receptor ST2 através da avaliação dos parâmetros: edema, atividade de mieloperoxidade, hiperalgesia mecânica, citocinas, expressão de RNA mensageiro e tratamentos farmacológicos inibindo o recrutamento leucocitário (fucoidina), TNF&#945; (infliximab), CXCL1 (anticorpo contra CXCL1), IL-1 (antagonista do receptor da IL-1), endotelinas, receptor ETA (clazosentan) e ETB (BQ788) e ciclooxigenase (indometacina). A fim de avaliar o papel da IL-33 na dor neuropática, a hiperalgesia mecânica também foi avaliada, os níveis de citocinas foram determinados por ELISA, ativação de proteínas foi determinada pelo método de western blot e, além disso, foram utilizadas ferramentas farmacológicas para alvos específicos. A injúria por constrição crônica foi induzida por ligação no nervo ciático. Diferenças estatísticas foram consideradas significativas para p<0.05. Os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de São Paulo e Universidade Estadual de Londrina. Os resultados demonstraram que a administração de carragenina aumentou a expressão de RNAm para ST2 e IL-33 e a produção de IL- 33 em amostras de pele de pata. Além disso, a administração de carragenina na pata induziu edema, hiperalgesia mecânica e atividade de mieloperoxidase, que foi reduzida nos animais ST2-/- em comparação com os selvagens, os mesmos efeitos foram observados pela administração de IL-33 na pata. A hiperalgesia induzida pela IL-33 foi reduzida pelo tratamento com fucoidina, sugerindo o papel do recrutamento de leucócitos no efeito hiperalgésico. Em animais naïve a hiperalgesia induzida pela IL-33 foi reduzida pelos tratamentos farmacológicos para os seguintes alvos, TNF-&#945;, CXCL1, IL-1, receptores de endotelina e ciclooxigenase, enquanto que a produção de TNF-&#945;, CXCL1, IL-1&#946;, IL-10 e PGE2, bem como, a expressão de RNAm para prepro-ET-1 induzidos pela carragenina foram dependentes do receptor ST2. A administração combinada de IL-33 e carragenina, em doses submáximas em tratamento único, induziu hiperalgesia, edema, atividade de mieloperoxidase e produção de citocinas de maneira dependente de ST2. Investigando o papel da IL- 33 na dor neuropática, foi demonstrado que a injúria por constrição crônica induz uma produção significativa de IL-33 na medula espinal (L4-L6) e aumento da hiperalgesia durante 20 dias, começando 3 dias após a cirurgia, a qual foi inibida em camundongos deficientes para ST2. A administração intratecal (i.t.) de IL-33 induziu a hiperalgesia de maneira dose-dependente, que foi inibida nos camundongos ST2-/- e TNFR1-/- e pelo tratamento com o antagonista do receptor da IL-1, bem como induziu a produção espinal de TNF&#945; and IL-1&#946;. A hiperalgesia induzida pela administração i.t. de IL-33 foi reduzida pelo tratamento com inibidores de PI3K, mTOR, MAP kinases (p38, ERK e JNK) e NF&#954;B. Corroborando, a injúria por constrição crônica induz a ativação espinal de PI3K, AKT, mTOR, MAP kinases e NF&#954;B, verificado pelo método de western blot, o que foi reduzido nos camundongos ST2-/-. O tratamento com minociclina e fluorocitrato inibiu a hiperalgesia induzida pela IL-33 e pela injúria por constrição crônica, e nos animais deficientes para o ST2-/-, houve redução na ativação de GFAP e Iba-1 na medula espinal. Dessa forma, a sinalização IL-33/ST2 é importante na produção de mediadores inflamatórios contribuindo para a inflamação induzida pela carragenina. Além disso, a via IL-33/ST2 medeia a dor induzida pela injúria por constrição crônica pela ativação de mecanismos espinais importantes, que incluem PI3K/AKT, mTORC1 e 2, MAPK (p38, ERK e JNK) e NF&#954;B. Esses dados reforçam a importância da sinalização IL-33/ST2 como alvo na dor inflamatória e neuropática. === IL-33 is a member of IL-1 family that signals through ST2 receptor. This cytokine is involved in adaptive inflammation-induced pain, however, the role of IL-33 on innate immune inflammation and neuropathic pain remains unknown. We report here the contribution of IL-33/ST2-triggered mechanisms to carrageenin-induced innate inflammation. Furthermore, it was investigated the role of IL-33 in chronic constriction injury of the sciatic nerve (CCI)-induced neuropathic pain in mice. In a first set of experiments, carrageenin- and IL–33-induced inflammatory responses were assessed in BALB/c- (WT) and ST2-deficient (-/-) mice as follows: oedema, myeloperoxidase activity, mechanical hyperalgesia, cytokine levels, PGE2, mRNA expression, drug treatment targeting leukocyte recruitment (fucoidin), TNF-&#945; (infliximab), CXCL1 (antibody to CXCL1), IL-1 (IL-1ra), endothelin ETA (clazosentan) and ETB (BQ788) receptors and COX (indomethacin). In orther to evaluate the role of IL-33 in neuropathic pain, mechanical hyperalgesia was also evaluated. Moreover, cytokine levels were determined by ELISA, protein activation was determined by western blot and specific targets were inhibited by pharmacological tools. CCI was induced by one ligation of the sciatic nerve. Statistical differences were considered significant for P<0.05. Procedures were approved by the Ethics Committee of University of Sao Paulo and Londrina State University. The result of our first study demonstrated that carrageenin injection increased ST2 and IL-33 mRNA expression and IL-33 production in paw skin samples. Furthermore, carrageenin-induced paw oedema, hyperalgesia and myeloperoxidase activity were reduced in ST2-/- compared with WT mice as well as carrageenin effects were mimicked by IL-33 injection in the paw. Furthermore, IL–33-induced hyperalgesia was reduced by fucoidin suggesting a role for recruited leukocytes in its hyperalgesic effect. IL–33- induced hyperalgesia in naïve mice was reduced by treatments targeting TNF, CXCL1, IL-1, endothelin receptors and cyclooxigenase while carrageenin-induced ST2-dependent TNF&#945;, CXCL1, IL-1&#946;, IL-10 and PGE2 production and preproET-1 mRNA expression. Combining IL-33 and carrageenin at doses that were ineffective as single treatment induced significant hyperalgesia, oedema, myeloperoxidase activity and cytokine production in a ST2-dependent manner. Investigating the role of IL-33 in neuropathic pain, we demonstrate that CCI induced significant IL-33 production in the spinal cord (L4-L6) and hyperalgesia during 20 days starting 3 days after surgery, which was inhibited in ST2-/- mice. intrathecal (i.t.) injection of IL-33 induced dose-dependent hyperalgesia, which was inhibited in ST2-/- and TNFR1-/- mice and by IL-1ra as well as IL-33 induced spinal production of TNF&#945; and IL-1&#946;. The hyperalgesia induced by i.t. injection of IL-33 was diminished by inhibitors of PI3K, mTOR, MAP kinases (p38, ERK and JNK) and NF&#954;B. In agreement, CCIinduced spinal activation of PI3K, AKT, mTOR, MAP kinases and NF&#954;B were reduced in ST2-/- mice compared to WT mice as determined by western blot. The treatment with minocicline and fluorocitrate inhibited IL-33-induced hyperalgesia and CCI-induced spinal activation of GFAP and Iba-1 were inhibited in ST2-/- compared to WT mice. Therefore, IL-33/ ST2 signaling triggers the production of inflammatory mediators contributing to carrageenin-induced inflammation. Furthermore, IL-33/ST2 signaling pathway mediates chronic constriction injury-induced pain by activating important spinal mechanisms including PI3K/AKT, mTORC1 and 2, MAPK (p38, ERK e JNK) and NF&#954;B. These data reinforces the importance of IL-33/ST2 signalling as a target in inflammatory and neuropathic pain.