Avaliação do efeito citotóxico do citral sobre células de melanoma murino metastático B16F10

• Main Author: Larissa Juliani Sanches
• Other Authors: Rodrigo Cabral Luiz .
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental. 2014
• Online Access: http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000191009

O melanoma representa 4% dos cânceres de pele registrados no Brasil. Quando diagnosticado precocemente pode ser removido cirurgicamente, mas quando a doença encontra-se disseminada é comum ser refratária às terapias disponíveise as terapias oferecidas são apenas paliativas. A resistência observada muitas vezes está associada a uma menor suscetibilidade à apoptose e alterações nas vias de proliferação e sobrevivência celular. As espécies vegetais são fontes de compostos naturais que apresentam atividades de interesse na preservação da saúde e no tratamento de doenças, varias classes de compostos químicos já foram descritos em literatura, mas alguns compostos como o citral foram pouco estudados. O citral é um aldeído alifático de ocorrência natural e é encontrado na forma de mistura isomérica de neral (cis) e geranial (trans). Por apresentar aroma de limão é utilizado como aromatizante de alimentos, bebidas e doces, assim como na produção de fragrâncias para artigos cosméticos e de higiene. Apesar de existirem poucos estudos com o citral, os existentes exibem atividades antiproliferativa e/ou citotóxicas sobre algumas linhagens de células neoplásicas. O presentre trabalho avaliou o efeito do citral sobre células murinas de melanoma metástatico (B16F10), cultivadas a 2x105 em placas de 24 poços, em meio de cultura Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco), suplementado com 5% de soro fetal bovino (SBF, Gibco) e 0,1% de solução antibiótica e antimicótica (Santa Cruz) e incubadas em estufa (Sanyo) a 37º C, com 5% de CO2 com umidade controlada de 95%. As células foram expostas ao citral por 24 horas nas concentrações0,1; 0,5; 1,0e 2,5µM, todos os experimentos foram realizados juntamente como grupo controle com DMSO na concentração de 1% em cultura.Após o período de tratamento, observamos redução na viabilidade célular a partir da concentração 0,5 µM. O IC50 foi estimado em 1,04 µM para 24 horas de tratamento e em 0,77 µM para 48 horas.Foram realizados ensaios de citotoxicidade e proliferação celular através do teste por exclusão com azul de Tripan. O citral foi capaz de reduzir a viabilidade a partir da concentração 0,5 µM para 24 e 48h, enquanto a proliferação celular reduziu a partir da concentração 0,5 µM para 24h e 0,05 µM para 48h, sugerindo efeito antiproliferativo nas concentrações 0,05 e 0,1 µM para 48h. Para determinar os padrões de morte celular estavam envolvidos, realizamos o teste de diferencial de morte com brometo de etídio/larajado de acridina(BE/LA), o teste de TUNEL para confirmar apoptose, o Lactato desidrogenase (LDH) liberado no meio de cultura para avaliar a necrose. No teste de coloração diferencial BE/LA o citral foi observado padrão apoptótico de morte celular a partir da concentração 0,5 µM e foi confirmado pelo teste TUNEL. O padrão necrótico foi observado a partir da concentração 1,0 µM, confirmado pela dosagem de LDH. Avaliamos a formação de vacúolos autofágicos através da coloração com monodansilcadaverina (MDC) e observamos indução de autofagia na concentração 1,0 µM. A indução de lesão de DNA foi avaliada pelo teste do Cometa em pH alcalino, onde foi observada indução de lesão a partir de 0,5 µM. Para determinar os parâmetros de estresse oxidativo realizamos a dosagem de glutationa reduzida (GSH), de malondialdeído (MDA), sendo observado consumo de GSH a partir da concentração 0,5 µM e aumento de MDA para concentração 2,5 µM. Para avaliar as espécies reativas envolvidas dosamos os níveis de óxido nítrico (NO) e utilizamos conhecidos sequestradores de espécies reativas de oxigênio (Tempol, trolox e L-histidina), onde observamos uma redução significativa dos níveis de NO e proteção contra o efeito citotóxico do citral para todos os sequestradores utilizados. Para verificar se o citral apresenta atividade oxidante direta realizamos o teste de consumo de oxigênio induzido por T-butil hidroperóxido em eritrócitos, onde não observamos efeito oxidativo direto do citral. Para elucidar a capacidade do citral de interferir em vias de sinalização intracelular, realizamos ensaios de imunocitoquimica para a proteínas ERK1/2, Pi3K,Akt, p53 e NFkB. O citralfoi capaz de diminuir os níveis de marcação imunocitoquímica para ERK1/2 celular na concentração 1,0 µM e nuclear nas concentrações 0,5 e 1,0 µM. Para as marcações de Pi3K e a Akt também observamos diminuição nas concentrações 0,5 e 1,0µM, enquanto para a p53 observamos aumento da marcação nas concentrações 0,5 e 1,0 µM. O citral foi capaz de aumentar a marcação de NFkB celular na concentração 1,0µM e diminuir a marcação nuclear do NFkB nas concentrações 0,5 e 1,0 µM. Finalmente para verificar a citotoxicidade do citral sobre células normais, cultivamos e tratamos as células de fibroblastos murino NIH-3T3nas mesmas condições que as células B16F10 e observamos que citral também induz citotoxicidade com IC50 24h estimado em 2,5 µM. Nossos resultados concordam com resultados obtidos por outros autores para outras linhagens de células tumorais. Confirmamos que o mecanismo de ação do citral envolve aapoptose e as proteínas p53 e NFkB, e acrescentamos o envolvimento de autofagia, do estresse oxidativo e das proteínas ERK 1/2 e Pi3K. O citral não apresentou seletividade, uma vez que apresente citotoxicidade sobre as células normais NIH-3T3, no entanto estas apresentam uma resistência maior ao citral (IC50de 2.5 µM 24h). Os resultados promissores in vitroapontam que o citral deve ser investigado in vivo em modelos experimentais de melanoma para averiguar seu efeito antitumoral no melanoma. === Melanoma represents 4 % of skin cancers recorded in Brazil. When early diagnosed, melanoma can be surgically removed, but when the disease is spread it is common to be refractory to available therapies and offered therapies are often palliative. The observed resistance is associated with decreased susceptibility to apoptosis and changes in the process of cell proliferation and survival. The plant species are sources of natural compounds which have interesting activities in health preservation and disease treatment, various classes of chemical compounds have been described in the literature, but some compounds such as citral, have a fewnumber of scientific studies. Citral is a naturally occurring aliphatic aldehyde and it is found in an isomeric mixture ofneral (cis), and geranial (trans). As citral has peculiar lemon scent, it is used as a food flavoring as well as in the production of fragrances for cosmetics and toilet products. Although there are few studies, antiproliferative and / or cytotoxic activity against cancer cells lineages have been described for citral. The presente study evaluated the effect of citral on murine cells metastatic melanoma (B16F10), cultured at 2x105 in 24 well plates inDulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM , Gibco ) supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS , Gibco) and 0.1% antibiotic and antimycotic (Santa Cruz ), and incubated in an incubator (Sanyo ) at 37 ° C with 5 % CO2 with controlled humidity of 95 %. Cells were exposed for 24 hours to citral at concentrations 0.1; 0.5; 1.0 and 2.5 µM, a control group with DMSO at a concentration of 1 % in culture, was also performed. After the treatment period, we observed a reduction in cell viability at concentrations higher than 0.5 µM. The IC50 was estimated at 1.04 µM for 24 h, and 0.77 µM for 48 h. Citral was able to reduce cell viability (by Trypan blue exclusion assay) at concentrations higher than 0.5 µMfor 24 and 48h, while reduced cell counting was observed for concentrations 0.5 µMfor 24h and 0.05 µM for 48 hours. To determine the patterns of cell death, we performed a differential colorimetric staining withethidium bromide/acridine orange (EB/AO), TUNEL assay to confirm apoptosis, measurement of lactate dehydrogenase (LDH) released into the culture medium to confirm necrosis. In differential staining EB/AO citral induced apoptotic pattern of cell death at concentrations higher than 0.5 µM, confirmed by TUNEL assay. Necrotic pattern was observed at concentrations higher than 1.0 µM, confirmed by LDH measurement. We evaluated the formation of autophagic vacuoles by monodansilcadaverina (MDC) staining, and we observed the induction of autophagy in citral 1.0 µM. The induction of DNA damage was evaluated by Comet assay in alkaline pH, citral induced DNA lesions in concentrations higher than 0.5 µM. To determine the parameters of oxidative stress we performed the measurement of reduced glutathione (GSH), and malondialdehyde (MDA) levels. GSH consumption was observed at concentrations higher than 0.5 µM and increased MDA levels were observed for citral 2.5 µM. To evaluate the reactive species involved in observed oxidative stress, we measured nitric oxide (NO) levels and used well-established scavengers of oxygenreactive species (Tempol, trolox and L- histidine). We observed a significant reduction in NO levels and protection against the cytotoxic effect of citral used scavengers. Direct oxidant activity was evaluated by t-butyl hydroperoxide-induce oxygen uptake in red blood cells test, and we observed no direct oxidative effect of citral. To elucidate the ability of citral to interfere with intracellular signaling pathways, we performed immunocytochemistry assays for ERK1/ 2, PI3K, Akt, p53, and NFkB proteins. Citral decreased cytoplasmatic ERK 1/2 labeling in concentrationshigher than 1.0 µM and nuclear ERK 1/2 labeling in concentrations higher than 0.5 and 1.0 µM. PI3K and Akt labelling were also decreased in the concentrations 0.5 and 1.0 µM, p53 labelling was increased. Citral also increasedcytoplasmatic NFkB labelling in the concentration of 1.0 µM, but decreased nuclear NFkB labelling at 0.5 and 1.0 µM. Finally, to check the cytotoxicity of the citral on normal cells and treated normal murine fibroblast NIH-3T3 in the same conditions of B16F10 cells, and observed that citral was also able to induce cytotoxicity in NIH-3T3, citral was not selective since it presented cytotoxicity againstNIH-3T3 cells, however these cells showed a higher resistance against citral (IC50 2.5 mM 24h ). Our results agree with scientific literature for other tumor cell lines. We confirmed that the mechanism of action of citral involves apoptosis as well as p53 and NFkB proteins, but also contributed to the knowledge of its mechanisms by including the involvement of autophagy, oxidative stress and ERK1/2 and PI3K proteins.The promising resultsobserved in vitro indicate that citral should be investigated inin vivo experimental models evaluate its antitumor effect against melanoma.