Hibridoma OTA.1 : anticorpo anti-OTA no desenvolvimento da coluna de imunoafinidade e aplicação associada à qualidade e segurança de vinho

• Main Author: Angélica Tieme Ishikawa
• Other Authors: Elisa Yoko Hirooka .
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos. 2012
• Online Access: http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000183300

O consumo moderado de vinho é recomendado baseado em efeito benéfico à saúde especialmente contra radicais livres, destaque ao resveratrol. O monitoramento na cadeia produtiva de vinho deve ser executado por método rápido, sensível e específico, evitando contaminação por ocratoxina A (OTA). Considerando o emprego de bioferramentas, com destaque a coluna de imunoafinidade (CIA) na extração/concentração do analito de interesse e o ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay), como base para avanço tecnológico, a exemplo de biossensor, procedeu-se o cultivo de Hibridoma OTA.1 produtor de anticorpo monoclonal (AcM) anti-OTA. O cultivo de Hibridoma OTA.1 foi iniciado em meio RPMI 1640 suplementado com Soro Fetal Bovino (SFB) e L-glutamina, a 37 °C sob 5% CO2, e gradualmente substituído por meio Hibridoma-Serum Free Medium (H-SFM) nas proporções 15, 30, 50, 75, 80 e 100%. O enriquecimento com 7 mmol L-1 de L-glutamina e cuidado especial em etapa inicial de cultivo, propiciou adaptação e expansão celular. O AcM obtido foi precipitado com sulfato de amônio a 60 % de saturação, dialisado e empregado na confecção de 6 CIAs experimentais, imobilizando 5 mg de AcM 100 % H-SFM (CIA 1 e 2); 75:100 % H-SFM (1:1) (CIA 3, 4 e 5) e 75% H-SFM (CIA 6) em um mL de suporte Affi-gel 10, com modificações na metodologia padrão. A Taxa de imobilização variou de 77,43±6,39 a 97,55±0,24 %, sendo a CIA 6 desenvolvida com AcM 75 % de H-SFM dialisado em PBS 0,015 mol L-1, com acoplamento a 4 ºC/24 h, apresentou alta atividade anti-OTA por i-ELISA, sugerindo que proteínas inerentes ao próprio cultivo favoreceram a imobilização de AcM. Em paralelo, vinho argentino elaborado a partir de Vitis vinifera (n=26), bem como o vinho paranaense, de Vitis Labrusca- Bordô (n=34), foram avaliados perante contaminação de OTA por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE, Limite de detecção- LD =0,05 ng mL-1 e Limite de quantificaçao - LQ= 0,07 ng mL-1) e ELISA competitivo indireto (ic-ELISA, LD= 0,17 ng mL-1 e LQ= 0,32 ng mL-1); além de característica de qualidade avaliada por capacidade antioxidante (CAO), trans-resveratrol e parâmetros cromáticos (L*-luminosidade, C*-croma e hgraus -tonalidade cromática) foram analisados em 60 amostras. Apenas uma amostra (0,12 ±0,01 ng mL-1) apresentou contaminação de OTA por CLAE, e 11 por ic-ELISA, com nível de contaminação abaixo do limite estabelecido pela legislação brasileira e Comunidade Européia (2 ng mL-1). A detecção falso-positivo de OTA por ic-ELISA foi explicado pela relação de trans-resveratrol e OTA (Análise de Componentes Principais -ACP), mostrando interferência de matriz. O vinho elaborado com Bordô apresentou média de CAO 4,57 mmol L-1, enquanto o vinho elaborado com V. vinifera, 8,35 mmol L-1. O trans-resveratrol foi detectado em 57 amostras de 60, sendo o nível em vinho Argentino (1,35 mg L-1) mais baixo em relação ao vinho Bordô (3,33 mg L-1) (p<0,05). O vinho de Paraná apresentou maior luminosidade em relação ao argentino, i.e., cor mais clara, entretanto valores de croma e tonalidade cromática não diferiram estatisticamente (p>0,05). Os vinhos sul-americanos mostraram perfil interessante apresentando níveis alto de antioxidante e baixa contaminação por OTA. Por outro lado, nível elevado de trans-resveratrol atuou como interferente em ic-ELISA resultando em falso-positivo, o conhecimento dessa influência permitirá aperfeiçoar o emprego dessa bioferramenta sensível aplicado ao vinho. === Moderate consumption of wine is recommend based on beneficial effect on health, with emphasis on resveratrol against free radical. The monitoring of wine in the production chain should be performed by rapid, sensitive and specific method, avoiding contamination by ochratoxin A (OTA). Whereas the use of biotools, specially the immunoaffinity column (IAC) in the extraction/concentration of the analyte of interest and ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay), as a basis for technological advanced, such biosensor, we proceeded to the Hybridoma OTA.1 cultivation producing monoclonal antibody (mAb) anti-OTA. The Hybridoma OTA.1 cultivation was started in RPMI 1640 medium supplemented with Fetal Bovine Serum (FBS) and L-glutamine at 37 ºC with 5 % CO2, and gradually replaced by 15, 30, 50, 75, 80 and 100 % of Hybridoma-Serum Free Medium (H-SFM). The enrichment with 7 m mol L-1 L-glutmine in initial stage cultivation promoted adaptation and cell expansion. The mAbs obtained was precipitated with ammoniun sulfate at 60 % saturation, dialyzed and used in the confection of 6 experimental IACs with 5 mg of Mab 100 % (IAC 1 and 2); 75:100 % (IAC 3,4 and 5) and 75 % H-SFM (IAC 6) on one mL of Affil-gel 10, with modification in standard methodology. The rate of immobilization ranged from 77.43 ± 6.39 to 97.55± 0.24 %, the developed IAC 6 prepared with mAb produced in 75 % H-SFM, dialyzed in 0.015 mol L-1 PBS, with coupling step performed at 4 ºC/24 h, showed higher performance concerning anti-OTA activity evaluated by indirect ELISA, suggesting that proteins involved on own cultivation probably favored the mAb immobilization. In parallel, the Argentinean wine produced with Vitis vinifera (n=26), as well as Paraná wine produced with Vitis labrusca- Bordeaux (n=34), were evaluated concerning OTA contamination by High Performance Liquid Chromatography (HPLC, Limit of detection - LD =0.05 ng mL-1 and Limit of quantification - LQ= 0.07 ng mL-1) and indirect competitive ELISA (ic-ELISA, LD= 0.17 ng mL-1 and LQ= 0.32 ng mL-1); also quality characteristic targeted on antioxidant capacity (AC), trans-resveratrol and chromatic parameter (L*- brightness, C*- chroma e hº- hue) were determinate a total of 60 samples. Only one sample (0.12 ±0.01 ng mL-1) showed OTA contamination by HPLC and 11 samples by ic-ELISA, with levels below the limit established by Brazilian legislation and European Community (2 ng mL-1). The OTA detection by ic-ELISA was explained with the relationship of trans-resveratrol and OTA (Principal Components Analysis -PCA), showing the influence of matrix interference. The Bordeaux wine showed AC mean of 4.57 mmol L-1, while the same profile analysis in V. vinifera showed mean of 8.35 mmol L-1. The trans-resveratrol was detected in 57 out of 60 samples, the Argentina wine samples (1.35 mg L-1) showed lower trans-resveratrol level than Bordeaux wine (3.33 mg L-1) (p<0,05). The Paraná wine showed higher brightness in relation to Argentinean wine, i.e., lighter color, however chroma and hue values did not differ statistically (p>0,05). The South-American wines showed interesting profile concerning high level of antioxidants in detriment to lower OTA contamination. On other hand, high trans-resveratrol level acted as interference in ic-ELISA resulting in false positive, knowledge of this influence will improve the use of the sensitive biotool.