Clonagem e caracterização de promotores de três isoformas de expansinas de Coffea arabica

• Main Author: Nathalia Volpi e Silva
• Other Authors: Luiz Filipe Protasio Pereira .
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular. 2012
• Online Access: http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000176356

A maturação de frutos do cafeeiro é um processo bioquímico e fisiológico que altera cor, sabor aroma e textura. Esses processos envolvem a expressão de diferentes enzimas e proteínas tais como as expansinas, responsáveis por promoverem o relaxamento da parede celular. A caracterização do padrão de expressão de expansinas do cafeeiro (CaExp1, 2 e 3) em diferentes tecidos do fruto despertou o interesse no estudo da região promotora desses genes. Deste modo este trabalho teve por objetivo clonar as regiões promotoras dos genes, CaExp1, CaExp2 e CaExp3 de C. arabica em duas cultivares IAPAR 59 e IAPAR 59 Graúdo; comparar e caracterizar in silico as regiões promotoras assim como validar a função do promotor (ProCaExp2). Os fragmentos dos promotores foram gerados utilizando o kit Genome Walker e ligados ao vetor PCR 2.1-TOPO. As sequencias foram comparadas utilizando os bancos de dados: PLACE, RegSite, MatInspector e PlantCare. A análise in silico dos promotores revelou a presença de motivos de resposta a luminosidade nos quatro promotores. Também foi observada a presença de motivos para fitorreguladores como etileno e auxina no ProCaExp2 e ABA, Brassinosteróides e GA nos ProCaExp1 e ProCaExp3. O ProCaExp2 foi fusionado ao gene GUSA e inserido via A. tumefaciens no tomateiro. A análise histomíquica do gene GUSA foi realizada em diferentes tecidos das plantas transformadas e controles não transformados. A análise da expressão do gene GUSA demonstrou que o ProCaExp2 direciona a expressão do gene para o endosperma antes do início da maturação e para o endosperma e polpa durante a maturação do fruto. A disponibilidade de promotores específicos é uma importante ferramenta biotecnológica para direcionar a expressão de genes para os frutos sem interferir em outros processos metabólicos das plantas. === The maturation of coffee fruits is a physiological and biochemical process that changes color, flavor, aroma and texture. These processes involve the expression of different enzymes and proteins such as expansins, responsible for promoting the cell wall expansion. The characterization of expression pattern of expansions (CaExp1, CaExp2, CaExp3) in different fruit tissues in coffee instigate the interest in the promoter region of these genes. Thus, this study aimed to clone the promoter regions of genes, CaExp1, CaExp2 and CaExp3 in two cultivars of C. arabica: IAPAR 59 and 59 IAPAR Graúdo in order to compare in silico these promoter regions and to validate the function of the promoter (ProCaExp2). Promoter fragments were generated using the Genome Walker kit and ligated to PCR 2.1-TOPO vector. These sequences were compared using the databases: PLACE, RegSite, MatInspector and PlantCare. The ProCaExp2 was fused to the GUSA gene and inserted via A. tumefaciens in tomato. In silico analysis of the promoters revealed the presence of motifs responsive to light in the four promoters analysed. Furthermore, we also detected the presence of motifs for growth regulators such as ethylene and auxin in ProCaExp2; and ABA, brassinosteroids and GA in ProCaExp1 and ProCaExp3. The histochemical analysis of the GUSA gene was accomplished in different stages of development in transformed and non transformed plants. The expression of gene GUSA demonstrated that the ProCaExp2 drives the gene expression to the endosperm before the beginning of maturation and for the endosperm and pericarp during maturation of the fruit. The availability of specific promoters is an important biotechnological tool to direct the expression of genes for fruit without interfering with other metabolic processes of plants.