Produção, caracterização e imobilização de Levanascarase de Bacillus subtilis natto de

A levanasacarase é uma frutosiltransferase de grande interesse biotecnológico por sintetizar levana, um exopolissacarídeo bacteriano formado por unidades de frutose, com potenciais aplicações na área terapêutica e nas indústrias de alimentos, cosméticos e medicamentos. A levanasacarase é produzida p...

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Bibliographic Details
Main Author: Bruna Caroline Marques-Gonçalves
Other Authors: Maria Antonia Pedrine Colabone Celligoi .
Language:Portuguese
Published: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Exatas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. 2012
Online Access:http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000172497
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description A levanasacarase é uma frutosiltransferase de grande interesse biotecnológico por sintetizar levana, um exopolissacarídeo bacteriano formado por unidades de frutose, com potenciais aplicações na área terapêutica e nas indústrias de alimentos, cosméticos e medicamentos. A levanasacarase é produzida por diversos micro-organismos, entre eles o Bacillus subtilis Natto, em presença de sacarose como fonte de carbono. Neste estudo a produção de levanasacarase foi otimizada empregando metodologia de superfície de resposta, avaliando a influência da concentração de sacarose, pH e agitação. A produção de levana foi acompanhada paralelamente e a enzima foi parcialmente caracterizada. A partir da condição otimizada para produção da levanasacarase, novos cultivos foram realizados para avaliar a influência dos sais NaCl, KCl e Na2SO4, em diferentes concentrações, na produção da enzima, na síntese de levana, e no crescimento da biomassa. A influência dos sais NaCl, KCl, ZnCl2, BaCl2, CaCl2, MnCl2, Na2SO4, FeSO4, CuSO4 foi avaliada na atividade da levanasacarase. Foram determinados a temperatura e o pH ótimos da enzima, a estabilidade térmica e a constante de Michaelis-Menten. A levanasacarase foi imobilizada em pasta de carbono e utilizada para a construção de um biossensor, que foi aplicado para detecção de sacarose em refrigerante e suco de abacaxi industrializado. A condição otimizada para a produção da enzima foi 300 g L-1 de sacarose, pH 7,5 e 160 rpm, com atividade de 8,57 UA mL-1. A maior produção de levana observada foi 205,92 g L-1. Os três sais testados na fermentação aumentaram a produção de enzima e de levana e reduziram a proliferação da biomassa; com destaque para o Na2SO4 que aumentou 100% a atividade da enzima, 200% a produção de levana e reduziu em 80% o crescimento do B. subtilis Natto. Dos sais avaliados na atividade enzimática, KCl, ZnCl2 e Na2SO4 foram indutores, NaCl não influenciou a atividade da enzima e os demais sais foram inibidores. O pH e a temperatura ótimos observados foram 6,0 e 50oC, a enzima se demonstrou termoativa e termoestável a 30º e com baixa afinidade pelo substrato sacarose (Km = 313 mM). O pH ótimo da enzima imobilizada foi 6,0, coincidindo com o da forma livre, e o Km aparente (Km ap = 833 mM) indicou redução na afinidade da levanasacarase pela sacarose após a imobilização. A detecção de sacarose em refrigerante e suco de abacaxi foi bem sucedida e os resultados indicaram ser um método comparável ao colorimétrico. Conclui-se que a cepa estudada é uma potencial produtora de levana e que a adição do sal Na2SO4 ao meio de cultivo é favorável para a produção da enzima e da levana, facilitando a sua obtenção, pois reduziu a proliferação da biomassa. Características como termo-estabilidade e termo-atividade tornam interessante a manipulação industrial desta enzima. O biossensor se demonstrou uma alternativa rápida e eficiente para a detecção de sacarose. === Levansucrase fructosyltransferase is a great biotechnological interest enzyme to synthesize levan, a fructan bacterian exoplysaccharide with potencial applications in therapeutic and in food, cosmetic and pharmaceutical industries. Levansucrase is produced by many microorganism, for example Bacillus subtilis Natto, on sucrose fermentation. This paper describe levansucrase production optimization using response surface methodology to evaluate the influence of sucrose concentration, pH and agitation. Levan production was monitored on fermentations and enzyme obtained was partially characterized. New fermentations to avaliate the influence of NaCl, KCl e Na2SO4 different concentrations salts on enzyme production from optimized condition was performed to analyse the influence on enzyme production, levan synthesis and biomass. NaCl, KCl, ZnCl2, BaCl2, CaCl2, MnCl2, Na2SO4, FeSO4 and CuSO4 influence were evaluated on levansucrase activity. Optimal temperature and pH value, thermal stability and Michelis-Mentes were investigated. Biosensor construction required levansucrase immobilized in carbon paste wich was used for the sucrose detection of refrigerant and industry pinneple juice. The optimized condition for enzyme production was 300 g L-1 sucrose, pH 7,5, 160 rpm with 8,57 UA mL-1 activity. The hightest levan production was observed 205,92 g L-1. All salts tested during fermentation increased enzyme and levan production and descreased biomass, Na2SO4 is an important salt that increased 100% enzymic activity, 200% levan production and decreased 80% B. subtilis Natto growing. Nine salts influence were evaluated on levansucrase activity. KCl, ZnCl2 and Na2SO4 were activity inducers and the remaining metal ions were inhibitors, except NaCl wich didn´t influence the enzyme activity. The optimum temperature and pH were 6,0 and 50oC, respectively, the enzyme was completely stable and activied at 30º and Km of levansucrase was 313 mM (low substrate affinity). Immobilized optimum pH enzyme was 6,0, coinciding with free form, and Km ap = 833 mM showed a reduction in the immobilized enzyme sucrose affinity. Refrigerant and industry pinneple juice sucrose determination were successful and the results are comparable with colorimetric method. Results indicated that the strains is a potencial levan producing and Na2SO4 fermentation addition salt in the medium is favorable for levansucrase and levan production, making it easier to obtain, for reducing biomass proliferation. Featurs such as thermal stability and thermal activity makes enzyme industry manipulation interesting. Biosensor demonstrated a fast and efficient alternative for sucrose detection.
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A partir da condição otimizada para produção da levanasacarase, novos cultivos foram realizados para avaliar a influência dos sais NaCl, KCl e Na2SO4, em diferentes concentrações, na produção da enzima, na síntese de levana, e no crescimento da biomassa. A influência dos sais NaCl, KCl, ZnCl2, BaCl2, CaCl2, MnCl2, Na2SO4, FeSO4, CuSO4 foi avaliada na atividade da levanasacarase. Foram determinados a temperatura e o pH ótimos da enzima, a estabilidade térmica e a constante de Michaelis-Menten. A levanasacarase foi imobilizada em pasta de carbono e utilizada para a construção de um biossensor, que foi aplicado para detecção de sacarose em refrigerante e suco de abacaxi industrializado. A condição otimizada para a produção da enzima foi 300 g L-1 de sacarose, pH 7,5 e 160 rpm, com atividade de 8,57 UA mL-1. A maior produção de levana observada foi 205,92 g L-1. Os três sais testados na fermentação aumentaram a produção de enzima e de levana e reduziram a proliferação da biomassa; com destaque para o Na2SO4 que aumentou 100% a atividade da enzima, 200% a produção de levana e reduziu em 80% o crescimento do B. subtilis Natto. Dos sais avaliados na atividade enzimática, KCl, ZnCl2 e Na2SO4 foram indutores, NaCl não influenciou a atividade da enzima e os demais sais foram inibidores. O pH e a temperatura ótimos observados foram 6,0 e 50oC, a enzima se demonstrou termoativa e termoestável a 30º e com baixa afinidade pelo substrato sacarose (Km = 313 mM). O pH ótimo da enzima imobilizada foi 6,0, coincidindo com o da forma livre, e o Km aparente (Km ap = 833 mM) indicou redução na afinidade da levanasacarase pela sacarose após a imobilização. A detecção de sacarose em refrigerante e suco de abacaxi foi bem sucedida e os resultados indicaram ser um método comparável ao colorimétrico. Conclui-se que a cepa estudada é uma potencial produtora de levana e que a adição do sal Na2SO4 ao meio de cultivo é favorável para a produção da enzima e da levana, facilitando a sua obtenção, pois reduziu a proliferação da biomassa. Características como termo-estabilidade e termo-atividade tornam interessante a manipulação industrial desta enzima. O biossensor se demonstrou uma alternativa rápida e eficiente para a detecção de sacarose. Levansucrase fructosyltransferase is a great biotechnological interest enzyme to synthesize levan, a fructan bacterian exoplysaccharide with potencial applications in therapeutic and in food, cosmetic and pharmaceutical industries. Levansucrase is produced by many microorganism, for example Bacillus subtilis Natto, on sucrose fermentation. This paper describe levansucrase production optimization using response surface methodology to evaluate the influence of sucrose concentration, pH and agitation. Levan production was monitored on fermentations and enzyme obtained was partially characterized. New fermentations to avaliate the influence of NaCl, KCl e Na2SO4 different concentrations salts on enzyme production from optimized condition was performed to analyse the influence on enzyme production, levan synthesis and biomass. NaCl, KCl, ZnCl2, BaCl2, CaCl2, MnCl2, Na2SO4, FeSO4 and CuSO4 influence were evaluated on levansucrase activity. Optimal temperature and pH value, thermal stability and Michelis-Mentes were investigated. Biosensor construction required levansucrase immobilized in carbon paste wich was used for the sucrose detection of refrigerant and industry pinneple juice. The optimized condition for enzyme production was 300 g L-1 sucrose, pH 7,5, 160 rpm with 8,57 UA mL-1 activity. The hightest levan production was observed 205,92 g L-1. All salts tested during fermentation increased enzyme and levan production and descreased biomass, Na2SO4 is an important salt that increased 100% enzymic activity, 200% levan production and decreased 80% B. subtilis Natto growing. Nine salts influence were evaluated on levansucrase activity. KCl, ZnCl2 and Na2SO4 were activity inducers and the remaining metal ions were inhibitors, except NaCl wich didn´t influence the enzyme activity. The optimum temperature and pH were 6,0 and 50oC, respectively, the enzyme was completely stable and activied at 30º and Km of levansucrase was 313 mM (low substrate affinity). Immobilized optimum pH enzyme was 6,0, coinciding with free form, and Km ap = 833 mM showed a reduction in the immobilized enzyme sucrose affinity. Refrigerant and industry pinneple juice sucrose determination were successful and the results are comparable with colorimetric method. Results indicated that the strains is a potencial levan producing and Na2SO4 fermentation addition salt in the medium is favorable for levansucrase and levan production, making it easier to obtain, for reducing biomass proliferation. Featurs such as thermal stability and thermal activity makes enzyme industry manipulation interesting. Biosensor demonstrated a fast and efficient alternative for sucrose detection. 2012-02-14 info:eu-repo/semantics/publishedVersion info:eu-repo/semantics/masterThesis http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000172497 por info:eu-repo/semantics/openAccess Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Exatas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. URL BR reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEL instname:Universidade Estadual de Londrina instacron:UEL