| Summary: | A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. Vários antígenos são detectados em preparado livre de células (CFA) de P. brasiliensis e dentre esses, uma fração de alta massa molecular (hMM) demonstrou efeito protetor parcial na PCM experimental. Recentes estudos vêm demonstrando a utilização de compostos doadores de óxido nítrico acoplados a metais de transição como transportadores de óxido nítrico (NO), sendo úteis no controle de algumas infecções. Assim, o presente estudo investigou a atividade protetora da fração de hMM em associação ou não com um composto doador de NO ([Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)]) e deste composto na PCM experimental. A fração de hMM foi obtida pelo fracionamento do CFA de P. brasiliensis em coluna de sephadex G-200 e utilizada na imunização dos camundongos. Os camundongos Balb/c foram divididos em 7 grupos: a) controle; b) Pb (infectado com 1x106 leveduras de Pb18); c) hMM (imunizado com 100μg da fração de hMM); d) hMM + Pb (imunizado e infectado); e) [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] (tratado com 100μM de [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)]); f) Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] (infectado e tratado); g) hMM + Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] (imunizado, infectado e tratado). O grau de proteção foi avaliada pela determinação de unidades formadoras de colônias (CFU), pela análise histopatológica do pulmão/fígado, pela resposta imune celular, pelos níveis de IgG anti-fração de hMM e pela dosagem de NO, após 28 dias de infecção. Os resultados obtidos demonstraram ausência de CFU e uma diminuição deste nos grupos imunizados (hMM, hMM + Pb e hMM + Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)]) e no grupo Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)], respectivamente, em relação ao grupo Pb (p<0.05). Nos cortes histológicos também foi observado ausência no grupo imunizado (fig 2B e 3B e tabela1) e uma diminuição do número de células fúngicas no grupo Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)]. Coerente com o CFU e o histológico, houve um aumento da resposta celular observado no grupo hMM + Pb em relação ao grupo Pb (p<0.05). Por outro lado, uma resposta celular reduzida foi observada no grupo hMM + Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] (p<0.05). Além disso, os níveis de IgG anti-fração de hMM foram elevados nos grupos hMM + Pb e hMM + Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] em relação aos demais (p<0.05). Os níveis de NO foram significativamente maior no grupo Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] em comparação aqueles somente [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] (p<0.05) e deste primeiro em relação ao grupo hMM + Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] (p<0.05). Adicionalmente, foi analisado o efeito da fração de hMM associada ou não com o tratamento [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] sobre macrófagos peritoniais murinos. O aumento dos níveis de NO tanto no grupo hMM como no grupo tratado com [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] em relação ao grupo controle (somente macrófagos) ou a diminuição dos níveis de NO nos grupos associados com hMM e [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)], em relação ao simples tratamento (p<0.05) foi detectado. Concluímos pelos resultados obtidos que a fração hMM induz proteção com eliminação total de fungos nos principais órgãos e, o tratamento com o [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] também induz proteção, porém parcial, nas condições do estudo. Tanto a fração hMM como o composto [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] induz aumento de nível sérico de NO na PCM experimental em camundongos e também induz aumento de produção/liberação de NO pelos macrófagos peritoneais murinos, mas diminuição dos níveis por essa associação. A associação da fração de hMM junto com o composto [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] também suprime, parcialmente, a proteção induzida pela hMM, possivelmente induzido pela modulação da resposta imune celular, o qual requer estudos posteriores. === Paracoccidioidomycosis (PCM) is a granulomatous disease caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. Several antigens are detected in cell-free preparation (CFA) of P. brasiliensis, among these a fraction of hight-molecular-mass (hMM) showed partial protective effect in experimental PCM. Recent studies have demonstrated the use of nitric oxide donor compounds bound to transition metals as carries of nitric oxide (NO) are useful in controlling some infections. Thus, this study investigated the protective activity of the hMM fraction in combination or not with NO donor compound ([Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)]) and this compound in experimental PCM. The fraction of hMM was obtained by P. brasiliensis CFA fractionation in sephadex G-200 columm and used for mice immunization. The Balb/c mice were divided into seven groups: a) control; b) Pb (1x106 infected with Pb18 yeast); c) hMM (immunized with 100μg the fraction of hMM); d) hMM + Pb (immunized and infected); e) [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] (treated with 100μM [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)]); f) Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] (infected and treated); g) hMM + Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] (immunized, infected and treated). The degree of protection was assessed by determination of colony forming units (CFU), histopathology of lung/liver, the cellular immune response, the levels of IgG fraction of hMM and by measuring levels of NO after 28 days of infection. The results showed absence of CFU and a decrease in the group immunized (hMM, hMM + Pb and hMM + Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)]) and in Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)], respectively, compared to Pb group (p<0.05). In histological sections it was also observed absence in immunized groups (fig 2B and 3B and table 1) and a decreased fungal cells number in the group Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)]. Consistent with the CFU and the histology, there was an increased in the cellular response observed in hMM + Pb group relative to Pb group (p<0.05). But by other side, reduced cellular response was observed in group hMM + Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] (p<0.05). Moreover, IgG anti- hMM fraction levels were higher in groups hMM + Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] and hMM + Pb compared to the others (p<0.05). NO levels were higher in Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] compared to [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] group (p<0.05) and this first group compared to hMM + Pb + [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] (p<0.05). Additionally, we analyzed the effect of the hMM fraction associated or not with NPS-Ru treatment on murine peritonial macrophages. Increased NO levels in the hMM as the [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] treated groups in relation to control group (only macrophages) or decreased NO level in hMM and [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] associated groups, in relation to single treatment (p<0.05) were detected. We conclude by the results that the fraction of hMM induces protection with complete elimination of fungi in the main organs and the treatment with [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] also induces protection, but partial, in the conditions of the study. Both the fraction of hMM as compound [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] induces increased serum levels of NO in experimental PCM in mice and also induces increased production/release of NO by murine peritoneal macrophages, but decreased level by its association. The association of hMM fraction together with the [Ru(Na2)Fe(CN5)(NO)] compound also partially suppressed the protection induced by hMM, possibly induced by modulation of cellular immune response, that require further study.
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