Expressão do gene da isopenteniltransferase (ipt) sob controle de promotor frio induzido em cana-de-açúcar

• Main Author: Nathalia Geraldo Belintani
• Other Authors: Luiz Gonzaga Esteves Vieira .
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular. IAPAR. EMBRAPA. 2010
• Online Access: http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000159986

A habilidade de resistir a baixas temperaturas e ao resfriamento é um fatordeterminante para a distribuição geográfica e para a produtividade de culturasagrícolas. Mesmo em áreas consideradas adequadas para o cultivo de dada cultivarou espécie, freqüentemente ocorre diminuição do rendimento e a quebra de safraem resposta às temperaturas de congelamento. A cana-de-açúcar é uma culturasensível ao frio, e apesar de ocupar regiões tropicais e subtropicais onde geadasnão são comuns, quando ocorrem, há quebras de safra e redução da qualidade dasplantas. Características como elevada ploidia, reduzida fertilidade, tamanho ecomplexidade do genoma, e interações complexas com o meio, tornam omelhoramento genético convencional laborioso para esta cultura. Atualmente, astécnicas de biotecnologia podem oferecer alternativas para a redução do tempo deobtenção de novos genótipos. Entre essas técnicas está a produção de plantastransgênicas, que abre novas perspectivas ao melhoramento convencional,permitindo a rápida incorporação de características desejáveis às espécies perenes.Portanto, a geração de variedades resistentes a estresses por meio da engenhariagenética é uma das principais ferramentas para o melhoramento na produção decana-de-açúcar. Os objetivos do presente trabalho foram 1) transformar plantas decana-de-açúcar com o gene ipt, de Agrobacterium tumefaciens, que codifica aenzima isopenteniltransferase, catalizadora do primeiro passo da biossíntese decitocininas em plantas, sob controle do promotor frio induzido COR15a deArabidopsis thaliana; e 2) avaliar a resposta ao estresse de baixas temperaturas dasplantas transformadas. Para isto, foram obtidos eventos de transformação porbiobalística da variedade RB855536, por co-transformação com o plasmídeopEmuKn, contendo o gene marcador de seleção nptII fusionado ao promotor Emu,de elevada expressão em monocotiledôneas. Foram obtidos 15 eventos cotransformados,confirmados via PCR. Destes, três eventos de transformação foramutilizados em experimentos para avaliação de senescência provocada por frio emfolhas destacadas. Neste experimento, os eventos de transformação apresentaramníveis mais elevados de clorofila total nos tratamentos, comparados à planta controlenão transformada, com visível redução da senescência. Em ensaio de tolerância aofrio em câmara de crescimento com plantas, quatro eventos foram escolhidos paraverificar tolerância ao frio. O conteúdo de clorofila total dos segmentos foliares doseventos transgênicos foi de 23 a 31% superior do que nas plantas controle apóstemperatura de congelamento. O nível de MDA nas plantas controle chegou a ser55% mais elevado do que o evento transformado com o maior nível de peroxidaçãolipídica, após as temperaturas de resfriamento e congelamento. Nas análises decondutividade elétrica, as plantas controle apresentaram maiores danos namembrana celular. A expressão do gene ipt foi verificada via RT-PCRsemiquantitativa com o gene normalizador gapdh, e a razão de expressão ipt/gapdhchegou a ser maior após o estresse, comparado ao início do ensaio. Os resultadosdo trabalho indicam o aumento de tolerância ao frio das plantas transgênicas decana-de-açúcar com inserção do cassete COR15a:ipt. === The ability to withstand low temperatures is a determining factor for the distributiongeographical and productivity of agricultural crops. Even in areas considered suitablefor the cultivation of a given cultivar or specie, often occurs reduced yields and cropfailure in response to freezing temperatures. Sugarcane is generally considered as acold-sensitive plant and despite occupy the tropics and subtropics where frost is notcommon, when it occurs there are crop failures and reduced quality of the plants.High ploidy, poor fertility, size and complexity of the genome, and complexinteractions with the environment, make sugarcane a good candidate for molecularbreeding. Biotechnology techniques can offer alternatives for reducing the time toobtain new genotypes. Among these techniques the production of transgenic plantsopens new perspectives to conventional breeding, allowing the rapid incorporation ofdesirable characteristics for perennial species. The generation of stress-resistantvarieties by genetic engineering is one of the main tools for improvement sugarcaneproduction. This work aimed to 1) transform sugarcane with the ipt gene(Agrobacterium tumefaciens) that encodes the enzyme isopenteniltransferase,catalysing the first step in biosynthesis of cytokinins in plants, under control of a coldinducible gene promoter COR15a (Arabidopsis thaliana) and 2) evaluate theresponse of of these transgenic plants to low temperatures stress. For this, eventswere obtained by biolistic transformation of sugarcane variety RB855536 by cotransformation with the plasmid pEmuKn containing the selection marker gene nptIIfused to the highly expressed monocot promoter Emu. Fifteen transgenic eventswere regenerated and confirmed via PCR. The analysis of three transformationevents used in experiments to evaluate senescence induced by cold in detachedleaves showed higher levels of chlorophyll in transformed events than the controlplant, with visible reduction of leaf senescence. Four events were chosen to verifycold tolerance of grown sugarcane plants in a growth chamber,. The total chlorophyllcontent of leaf segments of transgenic events was 23 to 31% higher than in controlplants after freezing temperature. The MDA level in control plants were 55% higherthan the transgenic plant with the highest level of lipid peroxidation after chilling andfreezing temperatures. In electrical conductivity analysis, the control plants showedgreater damage to the cell membrane. The expression of the ipt gene was detectedvia semiquantitative RT-PCR using GAPDH as the normalizer gene. The ipt/GAPDHexpression ratio was higher after cold stress compared to that was detected in theplants at the beggining of the experiment. Altogether, these results indicate theincreased cold tolerance of the COR15a:ipt transgenic sugarcane.