| Summary: | Campylobacter jejuni e Campylobacter coli são freqüentemente associadas à campilobacteriose humana, com mais de 80% das infecções causadas por C. jejuni. A infecção é esporádica e os surtos são raros. Além de gastrenterite, C. jejuni também tem sido associada a doenças auto-imunes pós-infecção, incluindo artrite, síndrome de Guillain-Barré (SGB), síndrome de Miller-Fisher e síndrome de Reiter. Aves e produtos avícolas têm sido implicados como os principais veículos para a infecção por Campylobacter. Métodos convencionais de isolamento e de identificação de Campylobacter em alimentos geralmente utilizam meios de enriquecimento seletivo com posterior subcultivo em meios sólidos seletivos. Estes métodos são muito demorados e após o isolamento, a identificação fenotípica requer testes bioquímicos e sorológicos adicionais. Os métodos moleculares, como reação em cadeia da polimerase (PCR) têm sido padronizados para detecção, identificação e quantificação de Campylobacter spp. em alimentos por serem rápidos, sensíveis e específicos. Os objetivos deste estudo foram desenvolver um ensaio PCR multiplex para detecção e diferenciação entre C. jejuni e C. coli em carcaças de frango, além disso, quantificar C. jejuni em culturas puras e detectar C. jejuni em carcaças de frango artificialmente e naturalmente contaminadas, por PCR em tempo real. A PCR multiplex foi desenvolvida utilizando iniciadores mapA específico para a detecção de C. jejuni e iniciadores ceuE específicos para detecção de C. coli. A PCR multiplex desenvolvida foi testada em 11 diferentes isolados de Campylobacter e 22 espécies não-Campylobacter e a especificidade do ensaio padronizado foi de 100%. A PCR multiplex padronizada foi também testada em carcaças de frango contaminadas artificialmente e naturalmente. Campylobacter foi detectada a partir da pele de frango artificialmente contaminada com cerca de 50 unidades formadora de colônia (UFC) de Campylobacter por 10 g de pele após 48 h de enriquecimento seletivo. Fragmentos específicos de PCR confirmaram a presença de C. jejuni (202 pb) e/ou C. coli (889 pb) em treze (46,4%) das 28 carcaças de frango adquiridas de supermercados locais de Londrina. Para os ensaios de PCR em tempo real foram utilizados iniciadores mapA específico para a detecção de C. jejuni. Os testes de especificidade da PCR em tempo real empregando os iniciadores mapA para os isolados de Campylobacter e isolados de outras espécies bacterianas indicaram que apenas os isolados de C. jejuni produziram os produtos de PCR com pico de dissociação de 76,3°C. O limite de detecção da qPCR foi estimado em cerca de uma cópia de DNA por PCR para as culturas puras de C. jejuni. O ensaio PCR em tempo real foi testado em carcaças de frango contaminadas artificialmente e naturalmente. C. jejuni foi detectada a partir de peles de frango artificialmente contaminadas com aproximadamente 1, 10 ou 50 unidades formadoras de colônia (UFC) de C. jejuni por 10 g de pele após 48 h de enriquecimento seletivo. Os produtos de PCR específicos foram observados em todas as amostras analisadas pela PCR em tempo real, após 48 h de enriquecimento seletivo quando o DNA foi extraído por fervura usando Triton X-100. A PCR multiplex e a PCR em tempo real padronizadas mostraram serem métodos rápidos, sensíveis e específicos na detecção de Campylobacter em carcaças de frango quando comparado aos métodos convencionais, que exige 5 dias para um resultado negativo e 6-7 dias para confirmar um resultado positivo. === Campylobacter jejuni and Campylobacter coli are frequently associated with human campylobacteriosis, with more than 80% of infections caused by C. jejuni. The infection is sporadic and outbreaks are rare. In addition to gastroenteritis, C. jejuni has also been associated to autoimmune diseases post-infection including arthritis, Guillain-Barré syndrome (GBS), Miller-Fisher syndrome and Reiter syndrome. Poultry and poultry products have been implicated as the major vehicles for Campylobacter infection. Conventional methods for the isolation and identification of Campylobacter from food products usually require enrichment culture and subculture on selective agar. These methods are time-consuming and after the isolation, phenotypic identification requires additional biochemical and serological tests. Molecular methods such as polymerase chain reaction (PCR) have been standardized for detection, identification and quantification of Campylobacter spp. in foods because they are rapid, sensitive and specific. The objectives of this study were to develop a multiplex PCR for detection and differentiation between C. jejuni and C. coli in chicken carcasses; moreover, quantify C. jejuni in pure cultures and detect C. jejuni with spiked and naturally contaminated chicken carcasses by real time PCR. The multiplex PCR was developed using mapA primers specific for detection of C. jejuni and ceuE primers specific for detection of C. coli. The multiplex PCR developed was tested on 11 different isolates of Campylobacter and on 22 non-Campylobacter species and specificity of the assay standardized was 100%. The PCR assay was tested with spiked and naturally contaminated chicken carcasses. Campylobacter was detected from chicken skin spiked contaminated with approximately 50 colony forming unit (CFU) of Campylobacter per 10-g after 48 h of selective enrichment. Specific DNA fragments of the PCR confirmed the presence of C. jejuni (202-bp) and or C. coli (889-pb) from thirteen (46.4%) out of 28 analyzed chicken carcasses purchased from local retail market, in Londrina. For real-time PCR assays were used mapA primers specific for detection of C. jejuni. Tests for specificity of real-time PCR using the gene mapA for isolates of Campylobacter and other bacterial genera showed that only isolates of C. jejuni produced PCR products with a peak separation of 76.3 ° C. The limit detection of qPCR was estimated at about one copy of DNA by PCR for pure cultures of C. jejuni. The real-time PCR assay was tested with spiked and naturally contaminated chicken carcasses. C. jejuni was detected from chicken skin spiked with approximately 1, 10 or 50 colony forming unit (CFU) of C. jejuni per 10-g of skin after 48 h of selective enrichment. Specific PCR products were observed in all samples analyzed by the real-time PCR after 48 h of selective enrichment when DNA was extracted by boiling using Triton X-100. The PCR multiplex and real-time PCR methods have shown to be rapid, sensitive and specific on the detection of Campylobacter in chicken carcasses, when compared with conventional methods that requires 5 days for a negative result and 6-7 days to confirm a positive result.
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