Quitinases de Beauveria bassiana : produção e polimorfismo genético

• Main Author: Danieli Cristina Sassá
• Other Authors: Geni Varéa-Pereira .
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Exatas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. 2006
• Online Access: http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000119378

Os fungos apresentam uma vantagem com relação a outros entomopatógenos, pois não precisam ser ingeridos para causar a infecção, penetrando o exoesqueleto do inseto por meio da ação de enzimas hidrolíticas como proteases e quitinases. Beauveria bassiana é um entomopatógeno amplamente estudado devido a sua capacidade de infectar e matar várias espécies de insetos. A produção de quitinases pode ser influenciada pela constituição da cutícula do hospedeiro e polimorfismos do gene codificador desta enzima pode ser uma das causas de alterações na capacidade de infecção do fungo. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o tempo de produção, propriedades cinéticas e purificação de quitinases de B. bassiana em meios de cultivo com e sem substratos indutores derivados de insetos; e verificar a existência de polimorfismos no gene da quitinase que possam estar relacionados com a atividade enzimática e mortalidade causada sobre a broca-do-café (Hypothenemus hampei). Para avaliar a produção e atividade de quitinases, a cepa CG432 foi cultivada em meio liquido contendo 1% de glucose ou adicionado de 1% de adultos mortos triturados de Zabrotes subfasciatus ou exúvias trituradas de larvas de Tenebrio molitor como substratos indutores, e inoculadas a 1% com uma suspensão 108 conídios/mL, a 28ºC a 150rpm. A verificação da ocorrência de polimorfismos no gene da quitinase foi realizada por meio da técnica de PCR-RFLP em 30 cepas de B. bassiana isoladas de diferentes espécies de insetos e várias origens geográficas cultivadas em meio de cultivo líquido contendo 1% de glucose como fonte de carbono. As quitinases produzidas em meio contendo somente glucose demonstraram atividade ótima em pH ácido de 5,5 e 6,0, e alcalino 8,5, a 45ºC. Estas quitinases apresentaram comportamento compatível com glicoproteínas de elevado teor de carboidratos durante a purificação, pois houve pequena definição do saldo de cargas elétricas da proteína durante a realização das cromatografias de troca-iônica em resinas tanto aniônicas como catiônicas. Os resultados obtidos durante e eletroforese e a dosagem de carboidratos, sugeriram que as quitinases poderiam estar associadas a outros carboidratos, possivelmente polissacarídeos produzidos durante o crescimento fúngico. A produção de quitinases ativas em pH ácido foi maior que as ativas em pH alcalino em todas as condições testadas. A atividade de quitinases com pH ótimo entre 5 e 6 foi detectada do 4º ao 9º dia de cultivo induzido enquanto que no cultivo sem indução quitinases ativas em pH ácido e alcalino, com pH ótimo de 8,5, foram detectadas com máximo de atividade no 5º dia de cultivo, diminuindo gradativamente até o 9º dia. A amplificação do gene da quitinase resultou em um produto de aproximadamente 1050pb para todas as cepas testadas e a análise do polimorfismo mostrou pouca variabilidade entre elas, uma vez somente 5 cepas apresentaram-se diferentes das demais não sendo possível correlacionar a ocorrência de variação com a mortalidade e a atividade enzimática. === Fungi present advantage regarding to other entomopathogens, therefore they do not need to be ingested to cause infection, penetrating in insect exoskeleton by hydrolytic enzymes action as proteases and chitinases. Beauveria bassiana is an entomopathogen widely studied which had its capacity of infect and killing many insects species. Production of chitinases can be influenced by host cuticle constitution and chitinase gene polymorphism can be one of the causes of alterations in the capacity of infection by fungus. In this way, the objective of this study was to evaluate the production time, kinetic properties and purification of chitinases produced by B. bassiana in medium with and without inductive substrate derived from insects; and to verify the existence of polymorphisms in chitinase gene that they can be related with the enzymatic activity and mortality caused on the coffee berry borer (Hypothenemus hampei). To evaluate the chitinases production and activity, strain CG432 was cultivated in medium containing 1% glucose or added of 1% dead adults triturated of Zabrotes subfasciatus or exuviae triturated of Tenebrio molitor larvae as inductive substrate, and inoculated 1% with a 108conidia/mL, at 28ºC at 150rpm. Verification of the occurrence of polimorphisms in chitinase gene was carried through by the technique of PCR-RFLP in 30 B.bassiana strains isolated of different insects species and geographic origins. Extracelluar chitinases and the biomass were obtained by culture of B. bassiana in liquid culture medium containing 1% glucose as carbon source. Chitinases produced in medium containing only glucose had demonstrated optimal activity in acid pH of 5,5 and 6,0, and alkaline 8,5, at 45ºC. These chitinases had presented compatible behavior with glycoproteins with high rate of carbohydrates during purification, therefore chitinases had protein electric load small defined during ion-exchange chromatography such in anionic as in cationic resins. The results obtained during electrophoresis and the dosage of carbohydrates, had suggested that chitinases could be associated to other carbohydrates, possibly polysaccharides produced during the fungal growth. Production of chitinases active in acid pH was greater that the active in alkaline pH at all test conditions. Optimum chitinases activity with pH between 5 and 6 was detected of 4th to 9th day of induced culture whereas in the culture without induction chitinases active in acid and alkaline pH, with pH excellent of 8,5, had been detected with maximum of activity in 5th day of culture, diminishing gradual until 9th day. The amplification of chitinase gene resulted in a product of 1050bp approximately for all strains tested and polimorphism analysis showed little variability between them, as 5 strains presented different, not being possible to correlate the occurrence of variation with mortality and enzymatic activity.