| Summary: | A restauração de imagens obtidas através de microscopia de seccionamento óptico computacional, utilizando técnicas de fluorescência, é um problema relevante em muitas aplicações biológicas. Diversos métodos foram propostos nos últimos anos com diferentes graus de sucesso para melhorar a qualidade destas imagens, mas a complexidade dos dados e o custo computacional do processamento ainda permanecem como fatores limitantes neste tipo de problema. Consideramos, neste trabalho, várias metodologias para a deconvolução de imagens tridimensionais obtidas em microscopia de fluorescência wide-field, onde propomos métodos lineares não iterativos e também algoritmos iterativos não lineares, que incorporam a presença do ruído Poisson nas observações devido à baixa contagem de fótons. Ainda, propomos duas abordagens específicas para a redução do ruído Poisson, sendo a primeira baseada em um critério de máximo a posteriori e a segunda na transformação de Anscombe. O primeiro algoritmo de deconvolução linear não iterativo é um método de dois passos baseado em um filtro de restauração não linear derivado a partir de um critério de máximo a posteriori, que considera uma distribuição de Poisson para modelar o ruído presente na imagem observada. O segundo, é um filtro de mínimo erro médio quadrático derivado usando o princípio da ortogonalidade no domínio de Fourier a partir de um modelo para o ruído Poisson. Os métodos iterativos não lineares são baseados na teoria de Projeções sobre Conjuntos Convexos, sendo que propomos o uso de cinco conjuntos de restrições convexas. Estas restrições são derivadas de forma a deconvoluir a imagem observada com a função de espalhamento pontual do microscópio, recuperar parte das freqüências perdidas devido à função de transferência óptica do sistema, garantir a positividade da solução e, também, prevenir erros introduzidos pelo processo de regularização. Os algoritmos foram analisados utilizando imagens sintéticas, com diferentes níveis de ruído Poisson e com imagens de espécimes reais. Os métodos também foram comparados com os algoritmos Maximum Likelihood Expectation Maximization e Regularized Linear Least Squares, apresentando boa performance em termos visuais e também uma boa relação custo-benefício. Ainda, propomos uma metodologia eficiente para a esqueletização tridimensional de estruturas tubulares, como neurônios e artérias, através do cálculo numérico de campos vetoriais e da estimação de curvaturas principais usando o mapa de Weingarten. Dada uma imagem binária, o método consiste em gerar uma imagem em tons de cinza, correspondente à magnitude de um campo de vetores, seguido por uma busca de pontos que pertencem aos vales de potenciais. Pode-se mostrar que estes pontos correspondem à transformação do eixo médio. Apresentamos resultados para contornos bidimensionais e também para imagens tridimensionais de neurônios e artérias. O algoritmo demonstrou uma boa performance, uma vez que o campo vetorial pode ser rapidamente calculado usando algoritmos de transformada rápida de Fourier
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The deconvolution of images obtained by means of optical-sectioning widefield fluorescence rnicroscopy, is a relevant problem in biological applications. Several methods have been proposed in the last few years, with different degrees of success, to improve the quality of the images, but the data complexity and the computational cost remain a limiting factor in this problem. We present in this work several methodologies to perform the deconvolution of three-dimensional data obtained by wide-field fluorescence microscopy. We present both linear, non-iterative and non-linear, iterative methods that take into accont the nature of the noise due to the low leve1 of photon counts. We also propose two algoritms to reduce the Poisson noise. The first one is based on a maximum a posteriori approach and the second one is based on the Anscombe transformation. The first linear, non-iterative algorithm is a two-pass method based on a nonlinear maximum a posteriori restoration filter derived using the Poisson noise model. The second linear, non-iterative deconvolution algorithm is a pointwise, space invariant, minimum mean square restoration filter for the Poisson image noise model derived using the orthogonality principle in the Fourier domain. The non-linear, iterative methods are based on the Projection onto Convex Sets theory. In the restoration algorithms, we combine five constraints sets in order to restore the out-of-focus blur, to retrieve the missing frequencies due to the transfer function of the optical system, to guarantee positiveness, and also to prevent the regularization errors. The methods were analysed using phantoms with several degrees of Poisson noise and with real ceil images. Also, they were compared with the Maximum Likelihood Expectation Maximization and Regularized Linear Least Squares algorithms. All the metodologies demonstrate good performance in terms of both visual results and cost-benefit analysis. We also propose an approach for efficient three-dimensional skeletonization of tubular structures, such as neurons and arteries, through fast numerical calculation of vector fields and curvature estimation by using the Weingarten formulae. In short, given a binary image, the method consists in generating a grayscale image corresponding to the magnitude of a vector field followed by a search of the points that belong to the botton of the potencial valleys. It can be shown that these points correspond to the media1 axis transformation. We present results for both two-dimensional shapes and three-dimensional arteries and neurons images. The algorithm has demonstrated a good performance due to the fact that the vector field can be easy and fastly calculated using the fast Fourier transform algorithm
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