Imunodiagnóstico da estrongiloidíase humana frente a diferentes frações antigênicas de Strongyloides venezuelensis

• Main Author: Marcelo Andreetta Corral
• Other Authors: Ronaldo Cesar Borges Gryschek
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2014
• Subjects: Antígenos de Helmintos; Ensaio de imunoadsorção enzimática; Estrongiloidíase; Imunodiagnóstico; Strongyloides venezuelensis; Western blotting; Antigens Helminth; Blotting Western; Enzyme-linked immunosorbent assay; Immunodiagnosis; Strongiloydiasis
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5134/tde-27082014-111103/

A estrongiloidíase é a infecção parasitária causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis. O diagnóstico definitivo é realizado pela visualização de larvas, principalmente nas fezes. Porém as técnicas parasitológicas têm baixa sensibilidade. As técnicas sorológicas apresentam-se como importante alternativa diagnóstica. Pesquisas apontam para a utilização de antígenos heterólogos solúveis, principalmente de Strongyloides venezuelensis. A identificação e caracterização dos antígenos de membrana podem fornecer fonte alternativa de antígenos e assim auxiliar o desenvolvimento das técnicas imunológicas. O presente trabalho teve como objetivo a avaliação das técnicas ELISA e WB frente a diferentes frações antigênicas de larvas filarioides de S. venezuelensis. Foram utilizadas amostras de sangue e fezes de 92 indivíduos, 20 indivíduos com estrongiloidíase (grupo I), 32 indivíduos com outras parasitoses (grupo II) e 40 indivíduos negativos (grupo III) pelos métodos de Lutz, cultura em placa de ágar e Rugai. Para preparação dos antígenos foram utilizadas larvas infectantes obtidas a partir de ratos infectados experimentalmente com S. venezuelensis. Seis frações antigênicas foram preparadas: frações salinas solúveis e de membrana (PBS 0,01M pH 7,2 e SDS 1%, SS e MS; Tris-HCl 25mM pH 7,5 e CHAPS 1%, ST e MT, respectivamente) e frações alcalinas solúvel e de membrana (NaOH 0,15M e SDS 1%, SA e MA, respectivamente). Para a técnica ELISA foram utilizadas placas sensibilizadas com 10ug/mL de antígeno, soro dos indivíduos diluídos 1:200 em PBS 0,05% Tween 3% de leite (PBSTM) e o conjugado (anti IgG-humana peroxidase) em PBSTM. As amostras foram consideradas positivas quando o Índice ELISA foi maior que 1. Para a técnica de WB os soros foram diluídos 1:100 em Tris-HCl 5% de leite (TM) e o conjugado (anti IgG-humana peroxidase) em TM. Após as técnicas sorológicas foram determinadas os parâmetros de diagnóstico pela curva ROC como sensibilidade (SE), especificidade (ES), Likelihood ratio (LR) além da determinação da acurácia diagnóstica (AC) e do índice Kappa (k). A técnica ELISA destacou as frações de membrana com melhor desempenho em relação aos parêmetros diagnósticos estudados (SE 95%, ES 94,4%, AC 94,8%, LR 17,1, k 0,848). O WB revelou componentes antigênicos imunodominantes variando de 260-10kDa, mas destacam-se as frações de 40-35kDa mais frequentes em todas frações antigênicas. Pela técnica de WB, a fração ST apresentou melhor desempenho em relação aos parêmetros diagnósticos estudados (SE 100%, ES 93,1%, AC 94,5, LR 14,4,k 0,854). A utilização das frações de membrana no imunodiagnóstico da estrongiloidíase humana torna-se fonte acessível e eficaz em relação às frações purificadas, não necessitando de gastos complementares para sua obtenção === Strongyloidiasis is a parasitic infection caused by a nematode Strongyloides stercoralis. The definitive diagnosis is made by the larvae visualization in stool samples. However parasitological techniques have low sensitivity. Serological techniques became as suitable diagnostic alternative. Research indicates for the soluble heterologous antigen utilization, mainly Strongyloides venezuelensis. Identification and characterization of membrane antigen may constitute an alternative source of antigen and then assist the development of serological techniques. The aim of this study was evaluate ELISA and WB techniques behind different antigenic fractions of S. venezuelensis´ infective larvae. A total of 92 serum and stool samples was analyzed, 20 from individuals with strongyloidisis (group 1), 32 with other parasitic diseases (group 2) and 40 from individuals with negative coproparasitology (group 3) using Lutz, agar plate culture and Rugai methods. For the antigen preparation infective larvae of S. venezuelensis from experimental infected rats were employed. Six antigenic fractions were prepareted: saline soluble and from membrane fractions (0.01M PBS pH 7.2, and 1% SDS, SS and MS; 25mM Tris-HCl pH 7.5, 1% CHAPS, MT and ST, respectively) and alkaline soluble and membrane fractions (0.15 M NaOH and 1% SDS, SA and MA, respectively). For ELISA technique, plates were sensitized with 10 ug/mL of antigen, serum samples were diluted 1:200 in 0.05% Tween in PBS 3% milk (PBSTM) and conjugate (anti-human IgG peroxidase) in PBSTM. Positive samples were considered when ELISA index was greater than 1. To WB technique, serum samples were diluted 1:100 in Tris-HCl 5% milk (TM) and conjugate (anti-human IgG peroxidase) in the TM. After serological techniques diagnostics parameters were determined by ROC curve how sensitivity (SE), specificity (ES), Likelihood ratio (LR) and determination of diagnostic accuracy (AC) and Kappa (k) index. ELISA technique highlighted the membrane fractions with better performance compared to parameters diagnoses studied (95% SE, 94.4% ES, 94.8% AC, 17.1 LR, 0.848 k). The WB revealed immunodominant antigenic components ranging from 260-10kDa, but there are the fractions of 40-35kDa more frequent in all antigenic fractions. WB technique showed ST fraction better performance in relation to the diagnostic parameters (100% SE, 93.1% ES, 94.5% AC, 14.4 LR, 0.854 k). Membrane fractions in the immunodiagnosis of human strongyloidiasis become an accessible and effective source of antigens in relation to the purified fractions, requiring no additional expense to obtain it