Expressão de AIF, PARP-1 e do microRNA-9 em modelo de isquemia cerebral experimental associada ao alcoolismo

• Main Author: Dayana Pousa Siqueira Abrahão
• Other Authors: Daniela Pretti da Cunha Tirapelli
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2016
• Subjects: Alcoolimo; Apptose; Isquemia cerebral; microRNA; Alcoholism; Apoptosis; Cerebral ischemia
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17137/tde-27012017-115339/

Objetivo: Analisar e descrever o perfil de expressão das proteínas relacionadas ao mecanismo de apoptose (PARP e AIF), e o perfil de expressão gênica sérica do microRNA-9 relacionado ao mecanismo de apoptose, em ratos submetidos à isquemia cerebral focal por oclusão da ACM por 90 minutos, seguida de reperfusão de 48horas, associado ou não com modelo de alcoolismo crônico. Métodos: Foram utilizados 20 ratos Wistar adultos, subdivididos em 4 grupos experimentais: grupo controle (C): animais submetidos apenas à anestesia; grupo isquêmico (I): animais submetidos à isquemia cerebral focal por 90 minutos seguido por reperfusão de 48 horas; grupo alcoolizado (A): animais que receberam diariamente álcool etílico absoluto diluído a 20% em água durante quatro semanas; e, grupo isquêmico e alcoolizado (IA): animais submetidos ao mesmo tratamento do grupo A e que, após quatro semanas foram submetidos à isquemia cerebral focal durante 90 minutos, seguido por reperfusão de 48 horas. As amostras do encéfalo coletadas foram processadas para a análise imunohistoquímica (para a expressão protéica de PARP-1 e AIF); e o sangue da artéria ventral da cauda foi coletado para a análise da expressão gênica do miRNA-9, relacionada ao mecanismo de apoptose, pela técnica de PCR em tempo real. Resultados: A comparação entre os grupos identificou uma redução da expressão proteica de PARP-1 nos animais do grupo AI quando comparado com os demais. Foi observada marcação positiva nuclear para a proteína AIF somente no grupo IA. Não houve diferença estatisticamente significante da expressão sérica do miRNA-9 entre os grupos. Conclusão: O modelo proposto, pode não ter sido suficiente para promover a ativação de AIF nos grupos C, A e I e desta forma, a apoptose celular por essa via analisada. A expressão proteica de PARP-1 no grupo A, associado com a expressão nula de AIF, indica um efeito neuroprotetor do etanol neste grupo. A redução da expressão proteica de PARP-1 não afetou sua atividade enzimática, proporcionando, mesmo em baixas concentrações, ativação de AIF no grupo IA. A expressão de PARP- 1 no grupo I, associada a expressão nula de AIF indica que o modelo de isquemia possivelmente gerou leves danos no DNA o que estimulou a ativação de PARP-1 somente em níveis suficientes para promover a reparação do DNA e não a ativação do processo de apoptose pela translocação de AIF. A expressão gênica sérica do miRNA- 9 observada indicou que a mesma foi suprimida quando exposta a mecanismos de estresse (alcoolismo, isquemia e a associação dos mesmos). A correlação do miRNA-9 com a expressão proteica de PARP-1 e AIF, indicou um aspecto protetor da baixa regulação do miRNA-9 tanto em animais alcoolizados como em animais isquêmicos. O grupo IA apresentou uma tendência a baixa expressão do miRNA-9, baixa expressão de PARP-1 e alta expressão de AIF, indicando que a associação álcool e isquemia tenha interferido no efeito protetor do miRNA-9 visto nos demais grupos === Aim: To analyze and describe the expression profile of proteins related to apoptosis mechanism (PARP and AIF), and profile of gene expression of miRNA-9 related to apoptosis mechanism in rats submitted to focal cerebral ischemia by occlusion of the CMA for 90 minutes, followed by 48 hours of reperfusion, associated or without associated to chronic alcoholism model. Methods: 20 adult Wistar rats were used, divided into 4 groups: control group (C): animals submitted only to anesthesia; Ischemic group (I): animals subjected to focal cerebral ischemia for 90 minutes followed by 48 hours of reperfusion; alcoholic group (A): animals that received daily solution of 20% of absolute ethyl alcohol diluted in water during four weeks; and ischemic group and alcoholized (IA): Animals subjected to the same treatment group A and after four weeks were subjected to focal cerebral ischemia for 90 minutes followed by 48 hours of reperfusion. The brain samples were collected and processed for immunohistochemical analysis (for protein expression - PARP-1 and AIF); and the blood from ventral artery of tail was collected for the analysis, by PCR in real time, of gene expression of miRNA-9 related to the mechanism of apoptosis. Results: The comparison between the groups identified a decrease in protein expression (PARP-1) in animals from IA group compared to others groups. Nuclear positive staining was observed for the AIF protein only in the IA group. There was no significant difference in serum expression of miRNA-9 between the groups. Conclusion: The proposed model may not have been sufficient to promote the activation of AIF in groups C, A and I, and thus the apoptosis analyzed in this way. Protein expression of PARP-1 in group A associated with a null expression of AIF, indicate a neuroprotective effect of ethanol in this group. The reduction of protein expression PARP-1 did not affect its enzymatic activity, providing even at low concentrations, activation AIF in IA group. The expression of PARP-1 in group I associated with null expression of AIF showed that model of ischemia, possibly, promoted light damage in DNA which stimulated PARP-1 activation just in sufficient levels to promote DNA repair, and without activation of apoptosis by translocation of AIF. The gene expression of miRNA-9 indicated that it was suppressed when exposed to mechanical stress (alcoholism, ischemia and combination thereof). The correlation of miRNA-9 with the protein expression (PARP-1 and AIF), indicated a protective aspect of downregulation of the miRNA-9 in both animals drunk as ischemic animals. IA group showed a trend to low expression of miRNA-9 and PARP- 1, in other hand an overexpression of AIF, indicating that the association between alcohol and ischemia interfered in protective effect of miRNA-9 seen in the other groups