A eletroforese capilar para a separação das metalotioneínas da cianobactéria (Synechococcus PCC 7942) e de mamíferos

• Main Author: Ana Clara Felix Vida
• Other Authors: Maria Fernanda Georgina Gine Rosias
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2011
• Subjects: Metalotioneínas de cianobacteria; Metalotioneínas de mamíferos; Separação por eletroforese capilar; Capillary electrophoresis separation; Cyanobacteria metallothioneins; Mammal metallothioneins
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/64/64133/tde-22062011-105023/

Metalotioneínas (MTs) são proteínas de baixa massa molecular, que tem como principal função a regulação dos níveis de metais nos organismos. A caracterização das MTs da cianobactéria Synechococcus PCC 7942 por eletroforese capilar foi feita em comparação com os padrões comerciais de MTs de rim de cavalo e de fígado de coelho. As MTs de mamíferos apresentam diferentes arranjos moleculares, classificadas em isoformas. Na aplicação da eletroforese capilar como metodologia analítica para a otimização da separação das isoformas existentes, foram investigados a influência da composição da solução eletrolítica, variações da voltagem, comprimento do capilar e diâmetro interno do capilar. Os perfis eletroforéticos das misturas das MTs purificadas a partir de rim de cavalo e fígado de coelho comparados com a de cianobactéria mostraram uma diferenciação no tempo de migração. Para a separação foram testados eletrólitos tais como fosfato, borato e TRIS-HCl, sendo que os melhores resultados foram obtidos com o tampão TRIS-HCl (70 mM, pH 8,2) com adição de 5% de metanol. A separação eletroforética foi testada em capilares de sílica fundida de 75 e 25 m d.i., comprimento de 40, 50 e 60 cm. As soluções das amostras em volume de 327 nL foram introduzidas por injeção hidrodinâmica. As diferenças de potencial testadas foram de 10, 15, 20 e 25 kV. As melhores condições de separação foram atingidas empregado TRIS-HCl com 5% metanol como solução eletrolítica, em capilar de 60 cm e diferença de potencial de 20 kV o que estabilizou a corrente de separação em 42 \'mü\'A. Os resultados mostraram que a eletroforese capilar mostrou-se eficiente para separação das MTs de mamifero e da Synechococcus devido às diferenças de carga e tamanho das moléculas === Metallothioneins (MTs) are low molecular weight proteins, which main functions are the regulation of metals levels in the body and detoxification. The capillary electrophoresis (CE) characterization of MT from Synechococcus cyanobacteria was attained by comparison with commercial standards of horse kidney and rabbit liver MTs. The influence of electrolyte, such as phosphate, borate and TRIS-HCl buffers on the separation performance were tested. Also, parameters such as voltage potential, capillary length and capillary inner diameter were investigated to attain optimized separation of mammal and Synechococcus MTs. The electrophoretic profiles of MTs revealed four abundant metallothionein isoforms for the horse kidney sample, one for rabbit liver MTII and two for cyanobacteria Synechococcus. The separation by CE of horse and cyanobacteria MTs mixtures differentiated two sets of signals, the first with four peaks corresponding to the horse sample and the last to Synechococcus. The mixture of rabbit liver MT and cyanobacteria MTs presented a first peak for rabbit MTII and a second for cyanobacteria. Tests were performed trying phosphate, borate and TRIS-HCl buffers, however the best results were attained with TRIS-HCl buffer (70 mM, pH 8.2) with addition of 5% methanol. Different capillary lengths of 40, 50 and 60 cm and two internal diameters of 75 and 25m were tested. Also, voltages of 10, 15, 20 and 25 kV were studied. The best experimental conditions were attained using a 60 cm long capillary, TRIS-HCl plus 5% methanol as electrolyte, the application of 20 kV which allowed maintaining a separation current of 42 \'mü\'A. Results demonstrated that capillary electrophoresis was efficient for separation of MTs of mammals from that of Synechoccocus due their differences on size to charge