Caracterização espectroscópica de complexos hipocrelina B: lantanídeos para uso em terapia fotodinâmica

• Main Author: Daniel José Toffoli
• Other Authors: Lilia Coronato Courrol
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2009
• Subjects: Biofísica; Espectroscopia; Fotossensibilizador; Hipocrelina B; Oxigênio Singleto; PDT; Terapia Fotodinâmica
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/85/85134/tde-22062009-104816/

Um estudo das propriedades ópticas do cromóforo hipocrelina B (HB) e de seus complexos com os íons lantânio (La3+), európio (Eu3+) e térbio (Tb3+) em soluções em etanol foi realizado. Tal pigmento enquadra-se como um promissor fotossensibilizador de segunda geração dadas suas ótimas propriedades, tais como rápido metabolismo in vivo e principalmente elevado rendimento quântico de geração de oxigênio singleto (FD). O presente trabalho foi desenvolvido em duas etapas: a primeira consistiu do estudo espectroscópico dos complexos de hipocrelina B (HB) com os íons lantanídeos (Ln3+), e a segunda, de testes de PDT in vitro em cultura do fungo Candida albicans. Na primeira etapa do trabalho, a melhor razão molar entre HB e Ln3+ foi verificada através do monitoramento do pico de absorção em maior comprimento de onda de cada um dos complexos. O maior deslocamento do pico de absorção da HB (de 589 nm para 614 nm) foi notado para os complexos com razão de 1 mol de HB para 2 mols de íon lantanídeo. Observou-se que a emissão da HB e de seus complexos ocorre desde cerca de 600 nm até 750 nm. Foi possível, com base nos espectros de absorção e de emissão, calcular os valores de níveis de energia da molécula e de seus complexos. Todos os fotossensibilizadores apresentaram como menor nível de energia valor superior a 0,98 eV, o que é um indício de sua capacidade de geração de oxigênio singleto. Foram determinadas as constantes de dimerização das amostras, de maneira a identificar sua tendência à formação de dímeros ou agregados de ordem superior, e os valores obtidos para a HB e seus complexos com lantânio, európio e térbio foram, respectivamente, de 4,7.104, 3,6.105, 2,1.105 e 1,0.105 M-1. Todas as amostras mostraram-se estáveis perante a ação de luz de 532 nm de até 400 mW/cm2 de intensidade pelo período de uma hora de irradiação. As capacidades de geração de oxigênio singleto das amostras foram determinadas tanto através do método espectroscópico direto (detecção da emissão do oxigênio singleto em torno de 1270 nm) quanto do método químico indireto (variações na absorção em 440 nm do composto RNO). Notou-se que para a HB o método direto indicou haver geração de oxigênio singleto, e o método químico revelou que esta espécie é gerada à taxa de 2,8.10-4 s-1; para HB:La3+ (1:1) obteve-se aumento de 32% na geração de oxigênio singleto em relação à HB, e para HB:La3+ (1:2), determinou-se taxa de 3,0.10-4 s-1 pelo método indireto. Com base nos dados experimentais obtidos, verificou-se que o melhor dentre os complexos estudados foi o HB:La3+ (1:2), sendo este e seu precursor HB então aplicados em testes de PDT antimicrobiana in vitro, constituindo a segunda etapa do trabalho. A concentração de HB ideal para trabalho obtida foi de 10 M. Notou-se eliminação total de microorganismos com apenas 30 segundos de irradiação com LED de 460 nm e intensidade de 333 mW/cm2 tanto para o complexo como para o seu precursor. Porém, com excitação em 660 nm com esta mesma intensidade, apenas HB:La3+ (1:2) se mostrou efetivo, chegando ao efeito fotodinâmico total após 6 minutos de irradiação; a redução causada pela HB no mesmo intervalo de tempo foi bem menos pronunciada, o que comprova a eficiência do fotossensibilizador produzido. === A study about the optical properties of the chromophore hypocrellin B (HB) and of its complexes with lanthanum (La3+), europium (Eu3+) and terbium (Tb3+) ions in ethanol solutions was realized. This pigment is a potential second generation photosensitizer due to its great properties, as high in vivo metabolism and mainly high singlet oxygen generation quantum yield (FD). The present work was carried out in two stages: the first one consisted of the spectroscopic study of the complexes of HB with lanthanide ions (Ln3+); the second one, of in vitro PDT tests against Candida albicans. In the first stage of the work, the best molar ratio between HB and Ln3+ was verified by monitoring the complexes longer wavelength absorption peaks. The larger red-shift (from 589 nm to 614 nm) was noted for the complexes with 1 mol of HB for 2 moles of lanthanide ions. It was observed that HB and its complexes emit from about 600 nm up to 750 nm. It was possible, from the absorption and emission spectra, to calculate the values of energy levels for the molecule and its complexes. All photosensitizers showed for the lower energy level value higher than 0,98 eV, which can indicate that they are able to generate singlet oxygen. The dimerization constants of the samples were determined, for verifying their tendency for giving rise to dimmers or higher order aggregates. The obtained values of this parameter for HB and its complexes with lanthanum, europium and terbium were, respectively, 4,7.104, 3,6.105, 2,1.105 and 1,0.105 M-1. All the samples showed to be stable against the action of light of 532 nm with intensity up to 400 mW/cm2 for the period of time of 1 hour. The capacities of generating singlet oxygen were determined by the direct (detection of the singlet oxygen emission around 1270 nm) and the indirect methods (changes in 440 nm absorption of RNO). The direct method indicated that HB can generate singlet oxygen, and the chemical method revealed that this specie is generated following a tax of 2,8.10-4 s-1; for HB:La3+ (1:1), it was obtained an enhancement of 32% on the singlet oxygen generation related to HB, and for HB:La3+ (1:2), the indirect method presented tax of 3,0.10-4 s-1. Based n the experimental data, the best among the studied complexes was HB:La3+ (1:2). Thus, this and its precursor, HB, were applied in antimicrobial PDT in vitro tests, the second stage of this work. The ideal concentration of HB was 10 M. With only 30 seconds of irradiation with LED in 460 nm and with 333 mW/cm2 of intensity, it was observed lethal effect for all the microorganisms, with both HB and its complex. However, with excitation at 660 nm at the same intensity, only HB:La3+ (1:2) was effective, reaching total photodynamic effect after 6 minutes of irradiation; the reduction caused by HB in the same time interval was lower, which proves the effectiveness of the produced photosensitizer.