Estudo das Proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de Nicotiana tabacum L. e seu Papel no Desenvolvimento Floral

• Main Author: Lígia Tereza Bertolino
• Other Authors: Maria Helena de Souza Goldman
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2014
• Subjects: Desenvolvimento; Família 14-3-3; Flor; Modulação de tamanho; SCI1; 14-3-3 family; Development; Flower; Size modulation
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-21052014-113419/

A modulação da forma e tamanho em órgãos vegetais depende do controle temporal e espacial de divisão e expansão celular. Entretanto, pouco se sabe a respeito dos mecanismos moleculares que regulam este processo durante o desenvolvimento floral. O estudo da via de sinalização de SCI1 (Stigma/style Cell Cycle Inhibitor 1) pode contribuir para o entendimento do processo de crescimento das flores. Este gene produz uma proteína, localizada no nucléolo, que está relacionada à inibição da proliferação celular no estigma e no estilete de Nicotiana tabacum, modulando o tamanho destes órgãos florais. Experimentos feitos para a identificação de parceiros de interação de SCI1 identificaram as proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de N. tabacum como candidatas à interação. A família 14-3-3 é composta de proteínas altamente conservadas, que formam dímeros em sua conformação nativa e são responsáveis pela modulação da atividade das mais variadas proteínas em resposta a sinais intracelulares. Por isso, estas proteínas estão associadas à regulação de uma série de processos, incluindo o metabolismo, transcrição, ciclo celular, entre outros. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo estudar as proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de N. tabacum e o seu papel durante o desenvolvimento floral. Os resultados aqui obtidos revelaram que a 14-3-3A possui localização citoplasmática e nuclear, enquanto a 14-3-3D se distribui apenas no citoplasma. Também foi evidenciado que estas proteínas são capazes de formar homodímeros e heterodímeros entre si. Os homodímeros de 14-3-3A estão distribuídos no citoplasma e no núcleo, enquanto os homodímeros de 14-3-3D e heterodímeros se encontram apenas no citoplasma. Adicionalmente, a interação in vivo entre a 14-3-3A e SCI1 foi confirmada por BiFC, apresentando localização nuclear, fora do nucléolo. Análises in silico da sequência de aminoácidos de SCI1 identificaram duas regiões putativas de reconhecimento por proteínas 14-3-3s. Estas regiões estão sendo analisadas funcionalmente por meio de ensaios de BiFC com sequências mutadas de SCI1. A análise deste conjunto de resultados, juntamente com outros resultados obtidos em nosso laboratório, sugere que apenas homodímeros de 14-3-3D e heterodímeros formados entre 14-3-3A e 14-3-3D sejam capazes de interagir com SCI1. Adicionalmente, a localização nuclear dessa interação difere daquelas observadas para SCI1 e para as 14-3-3s individualmente, sugerindo que as 14-3-3s migrem para o núcleo para interagir com SCI1. Nossa hipótese é de que as proteínas 14-3-3s possam modular a localização subnuclear de SCI1. Com o objetivo de levantar dados a respeito das possíveis funções desempenhadas pelas proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de N. tabacum, foram identificados os grupos de possíveis ortólogos dessas proteínas em A. thaliana, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum e N. benthamiana. Esta análise mostrou que os ortólogos às 14-3-3A e D em Arabidopsis estão associados ao ciclo celular, o que sugere que as proteínas de tabaco possam ter conservado essa função. Além disso, também foram produzidas plantas transgênicas silenciadas para cada uma dessas 14-3-3s de maneira independente. A análise dos fenótipos das plantas transgênicas não levou à elaboração de uma hipótese definitiva sobre a função dessas 14-3-3s no desenvolvimento floral. No entanto, algumas plantas transgênicas apresentaram estruturas menores, especialmente as pétalas, sugerindo que estas proteínas podem estar envolvidas no controle do tamanho de órgãos vegetais. === The modulation of size and shape in plant organs depends on temporal and spatial control of cell division and expansion. However, the molecular mechanisms that regulate this process during floral development are poorly understood. The study of SCI1 (Stigma/style Cell Cycle Inhibitor 1) signaling pathway can contribute to the understanding of the flower growing process. This gene produces a protein which is located in the nucleolus and is related to the inhibition of cell proliferation in the Nicotiana tabacum stigma and style, modulating the size of these organs. Experiments performed to identify SCI1 interaction partners have identified the N. tabacum 14-3-3A and 14-3-3D proteins as interaction candidates. The 14-3-3 family is composed of highly conserved proteins, which form dimers in their native conformation and are responsible to modulate the activity of a large variety of proteins in response to intracellular signals. Therefore, these proteins are associated to the regulation of several processes, including metabolism, transcription, and cell cycle, among others. In this context, the present work aimed to study the N. tabacum 14-3-3A and 14-3-3D proteins and their role during flower development. The results here obtained revealed that 14-3-3A is located in the nucleus and the cytosol, while 14-3-3D protein is distributed only in the cytosol. It was also shown that these proteins can form homodimers and heterodimers with each other. Homodimers of 14-3-3A are distributed in nucleus and cytosol, while 14-3-3D homodimers and heterodimers are located only in the cytosol. Furthermore, the in vivo interaction between SCI1 and 14-3-3A was confirmed by BiFC, showing nuclear localization, outside the nucleolus. In silico analyzes of SCI1 amino acid sequence identified two putative regions of recognition by 14-3-3 proteins. These regions are being evaluated by BiFC assays with SCI1 mutated sequences. The analyses of this set of results, together with other results obtained in our laboratory, suggests that only 14-3-3D homodimers and heterodimers between 14-3-3A and 14-3-3D are capable to interact with SCI1. Moreover, the nuclear localization of this interaction differs from the ones observed for SCI1 and for the 14-3-3s individually, which suggests that the 14-3-3s migrate to the nucleus to interact with SCI1. Our hypothesis is that the 14-3-3 proteins can modulate the subnuclear localization of SCI1. To obtain data concerning the possible roles of the N. tabacum 14-3-3A and 14-3-3D proteins, groups of possible orthologous of these proteins in A. thaliana, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum and N. benthamiana were identified. This analysis has shown that the orthologs of 14-3-3A and D in Arabidopsis are associated to the cell cycle, suggesting that the tobacco proteins might have conserved this function. Furthermore, transgenic plants silenced for each of the 14-3-3s independently were also produced. Phenotype analyzes of transgenic plants did not lead to a definitive hypothesis about the function of these 14-3-3s during floral development. However, some transgenic plants exhibited smaller structures, specially petals, which suggests that these proteins may be involved in the size control of plant organs.