Identificação e análise funcional de genes relacionados à transdução de sinais na cana-de-açúcar

• Main Author: Flávia Riso Rocha
• Other Authors: Glaucia Mendes Souza
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2006
• Subjects: Biologia molecular; expressão gênica; genoma; gene expression; genome; molecular biology
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-18092006-224457/

Diversos processos envolvidos no crescimento, desenvolvimento e adaptação a variações ambientais são regulados por vias de transdução de sinal. O projeto SUCAST (Sugarcane Signal Transduction Project) tem como objetivos a identificação e caracterização funcional dos componentes de transdução de sinais da cana-de-açúcar (Souza et al., 2001). O presente trabalho insere-se dentro do Projeto SUCAST e teve como foco a identificação de componentes de transdução de sinais, a categorização desses elementos utilizando-se ferramentas de bioinformática e a avaliação de seus perfis de expressão pela tecnologia de microarranjos de cDNA. Genes relacionados à transdução de sinais foram buscados entre as seqüências armazenadas no banco de dados SUCEST - The Sugar Cane EST Project (Vettore et al., 2003) - pela ferramenta de BLAST, o que permitiu a categorização de mais de 3.500 genes relacionados a vias de sinalização em cana-de-açúcar. A categoria de proteínas quinases foi também analisada quanto à presença de domínios conservados e classificada por agrupamento filogenético do domínio catalítico predito. Com a análise filogenética, foram obtidos seis grupos característicos para proteínas quinases e quatro grupos principais de receptores do tipo Ser/Thr quinases. Um total de 527 genes do quinoma de cana foi analisado. Os padrões de expressão de componentes do catálogo SUCAST foram avaliados em seis órgãos (raiz, flor, folha, gema lateral, primeiro e quarto entrenós), em resposta a diferentes estímulos (tratamentos com os fitormônios ácido abscísico e metiljasmonato, seca, interação com bactérias diazotróficas endofíticas, ataque por Diatraea saccharalis e deficiência em fosfato) e em populações contrastantes para acúmulo de sacarose. As análises dos dados de microarranjos mostraram 217 genes diferencialmente expressos em pelo menos um dos órgãos analisados e 153 genes considerados de expressão ubíqua. Para os experimentos de respostas a tratamentos com fitormônios e estímulos ambientais, 179 genes diferencialmente expressos em pelo menos uma das condições analisadas foram identificados. Cinqüenta e um genes mostraram-se diferencialmente expressos ao se comparar amostras (folhas +1 e entrenós em diferentes fases de maturação) de duas populações contrastantes para acúmulo de sacarose. Os perfis de expressão foram também analisados ao longo do tempo para os experimentos de deficiência em fosfato, seca e tratamentos com fitormônios, através de agrupamentos por Self-Organizing Maps (SOM). Resultados de PCR em tempo real confirmaram os dados de expressão para 72% de 25 genes selecionados para comparações entre diferentes órgãos, e 80,5% de 36 perfis de expressão selecionados para experimentos de resposta a tratamentos com hormônios e a estímulos ambientais. Adicionalmente, reações de PCR em tempo real foram realizadas para se avaliar os níveis de expressão de cinco genes selecionados em indivíduos contrastantes para acúmulo de sacarose e 57% dos resultados obtidos mostraram-se de acordo com os dados de microarranjos. Todos os dados obtidos foram integrados e compilados no banco de dados SUCAST (http://www.sucest-fun.org). O conhecimento gerado com o projeto representa um progresso significativo na compreensão da função de alguns dos genes identificados no projeto SUCEST, indicando alvos a serem explorados no programa de melhoramento da cana-de-açúcar. === A diversity of processes related to growth, development and adaptation to environmental conditions are regulated by signal transduction pathways. The SUCAST Project (Sugarcane Signal Transduction) (Souza et al., 2001) aims to identify, characterize and associate putative functions to sugarcane signal transduction components using bioinformatic tools and to evaluate their expression profiles using cDNA microarrays. BLAST searches conducted on sequences stored in the SUCEST databank - The Sugar Cane EST Project (Vettore et al., 2003) - revealed more than 3,500 putative genes related to signaling in sugarcane. The protein kinases were anaçyzed for the presence of conserved domains and classified according to a phylogenetic analysis of the predicted catalytic domain. The phylogenetic approach indicated six characteristic groups for protein kinases and four mains groups for receptor-like kinases. The expression patterns of SUCAST components were evaluated in six organs (root, flower, leaf, lateral bud, first and fourth internodes), in response to different stimuli (treatment with the phytohormones abscisic acid and methyljasmonate, drought, endophytic bacteria interaction, attack by Diatraea saccharalis and phosphate deficiency) and in sugarcane cultivars contrasting for sucrose accumulation. The tissue profiling experimenta showed 217 differentially expressed genes in at least one of the six organs analyzed and 153 genes of ubiquitous expression. A total of 179 differentially expressed genes were obtained in response to phytohormones and environmental stimuli, in at least one of the conditions analyzed were obtained. Comparisons between high and low sucrose (brix) cultivars led to the detection of 51 differentially expressed genes in at least one of the samples analyzed (leaves +1 and internodes at different maturing stages). The expression patterns were also analyzed in time-course experiments of phosphate deficiency, drought and phytohormone treatments by Self-Organizing Maps (SOM) clusterization. Quantitative PCR results confirmed 72% of the microarray expression data in sugarcane organs for 25 selected genes and 80.5% of the 36 expression profiles selected in response to phytohormones and environmental stimuli. Additionally, real-time PCR reactions were carried out to evaluate the expression levels of five genes in individuals contrasting for sucrose accumulation and 57% of the results obtained were in agreement with the microarray data. All data generated were integrated and compiled into the SUCAST databank (http://www.sucest-fun.org). The knowledge generated adds to the comprehension of the function of SUCAST components, indicating targets to be explored in the improvement of sugarcane cultivars.