Caracterização funcional e estrutural do sistema Tiorredoxina mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae

• Main Author: Eduardo Hiroshi Nakamatsu
• Other Authors: Luis Eduardo Soares Netto
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2012
• Subjects: Ensaios enzimáticos; Estrutura; Mitocôndria; Saccharomyces cerevisiae; Sistema tiorredoxina; Enzymatic assays; Mitochondria; Structure; Thioredoxin system
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41131/tde-18012013-155201/

NADPH, tiorredoxina e tioredoxina redutase compõem o sistema tiorredoxina, estão envolvidos na redução de ligações específicas de dissulfetos que desempenham um grande número de funções biológicas, tais como: síntese de DNA, defesa contra o estresse oxidativo, apoptose e sinalização redox. Tem sido demonstrado que as interações tioredoxina redutase-tiorredoxina são espécies específicas, sendo assim, investigamos aqui a especificidade dos substratos da tioredoxina redutase 2 mitocondrial (ScTrxR2) de Saccharomyces cerevisiae frente a outras tioredoxinas. ScTrxR2 especificamente reduziu as tiorredoxinas de levedura (tiorredoxina 1 = ScTrx1, tiorredoxina 2 = ScTrx2 e tiorredoxina = ScTrx3), mas não conseguiu reduzir a tiorredoxina de Homo sapiens e a de Escherichia coli. Além disso, ScTrxR2 exibiu eficiência catalítica semelhante para ScTrx3, que está localizado na mitocôndria e ScTrx1 e ScTrx2 que estão localizadas no citosol. Para compreender as características deste fenômeno, resolvemos a estrutura cristalográfica da ScTrxR2 a 1,9 Å de resolução por meio de substituição molecular utilizando as coordenadas de ScTrxR1 (PDB Id = 3ITJ) como modelo (Oliveira et al., 2010). A ScTrxR2 é uma proteína de dois domínios (domínio de ligação do NADPH e domínio de ligação do FAD). As tiorredoxinas redutases de baixo peso molecular podem adotar duas conformações: flavina oxidada (FO) e flavina reduzida (FR), estando esta última envolvida na interação física com as tiorredoxinas. A estrutura cristalográfica da ScTrxR2 obtida por nós está na conformação FO. Posteriormente, modelamos a conformação FR (Flavina reduzida) da ScTrxR2, a partir da estrutura do cristal na conformação FO, e utilizando a estrutura cristalográfica da tiorredoxina redutase de E. coli complexada com a tiorredoxina (PDB 1F6M). Pela análises dessas estruturas, levantamos hipóteses de que alguns resíduos de aminoácidos podem estar envolvidos nas interações espécie-específicas entre tiorredoxina redutase e tiorredoxina. Com isso, geramos mutantes sítio dirigidos das Trx de levedura e da ScTrxR2 e através de ensaios enzimáticos e bioquímicos com estas proteínas mutantes estamos testando as hipóteses levantadas sobre possíveis amino ácidos envolvidos em interações entre tiorredoxina e tiorredoxina redutase === NADPH, thioredoxin and thioredoxin reductase, comprising the thioredoxin system, are involved in the reduction of specific disulfides linkages that play a large number of biological roles, such as: DNA synthesis, defense against oxidative stress, apoptosis and redox signaling. It has been shown that thioredoxin reductase-thioredoxin interactions are species-specific, therefore we have investigated here the substrate specificity of mitochondrial Thioredoxin reductase 2 (ScTrxR2) from Saccharomyces cerevisiae towards other thioredoxins. ScTrxR2 specifically reduced yeast thioredoxins (thioredoxin 1 = ScTrx1, thioredoxin 2 = ScTrx2 and thioredoxin = ScTrx3), but failed to reduce thioredoxin from Homo sapiens and from Escherichia coli. Furthermore, ScTrxR2 displayed similar catalytic efficiency towards ScTrx3, which is located in the mitochondria and ScTrx1 and ScTrx2 that are located in the cytosol. To understand the features of this phenomenon, we have solved the crystallographic structure of ScTrxR2 at 1,9Å resolution through molecular replacement using ScTrxR1 as search model (Oliveira et al., 2010)1. ScTrxR2 is a two-domain protein (NADPH and FAD binding domains). Low molecular weight thioredoxin reductases can adopt two conformations: flavin oxidized (FO) or flavin reduced (FR), the late one physically interacts with thioredoxins. Our ScTrxR2 crystal structure is in the FO conformation. Therefore, we have modeled the ScTrxR2 FR (Flavin reduced) conformation from our FO crystal structure and using the E. coli thioredoxin reductase crystallographic structure complexed with thioredoxin (PDB code 1F6M). Then, we have raised hypothesis that some amino acid residues that may be involved in the thioredoxin reductase-thioredoxin interactions. Next, site-directed mutants of yeast Trxs and ScTrx2 were generated. Through enzymatic and biochemical assays with these mutant proteins we are testing the hypothesis generated by structural analysis