Avaliação de métodos de extração de DNA de Cryptosporidium spp. em amostras fecais e comparação de nested PCR com o médodo coproparasitológico de centrífugo-flutuação em sacarose

• Main Author: Mikaela Renata Funada
• Other Authors: Rodrigo Martins Soares
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2009
• Subjects: Cryptosporidium; Diagnóstico (métodos); DNA (extração); Fezes; Reação em cadeia polimerase; Diagnosis (methods); DNA (extraction); Feces; Polymerase chain reaction
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-17042009-153638/

O desempenho de seis métodos de extração de DNA de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes foram avaliados pela nested PCR do gene SSU rRNA. Os métodos consistem na combinação com pequenas variações de duas técnicas para a liberação de esporozoítos (indução de excistamento/E ou choque térmico/C) e três técnicas de purificação de DNA (fenol-clorofórmio/F, GuSCN-sílica/S ou kit QIAmp DNA Stool Mini/K). Para a avaliação da sensibilidade analítica, os testes foram realizados a partir de diluições seriadas de oocistos purificados, na ausência e na presença de 100 μl de fezes bovinas. A sensibilidade diagnóstica foi avaliada pela comparação com o método microscópico de centrífugo-flutuação em sacarose (padrão-ouro) em 15 amostras fecais de diferentes hospedeiros naturalmente infectados. Na ausência de fezes, foram avaliados apenas os métodos EF, ES, CF e CS, sendo que EF apresentou sensibilidade analítica superior, possibilitando a detecção de até 1 oocisto. Na presença de fezes, os métodos EF, EK e CK apresentaram desempenhos equivalentes, com sensibilidade de 104 oocistos. As maiores sensibilidades diagnósticas foram obtidas pelos métodos EK e CK, que possibilitaram a detecção de 13 (86,7%) das 15 amostras. Devido à alta sensibilidade analítica de EF em amostras purificadas, avaliou-se sua sensibilidade diagnóstica em amostras de oocistos purificados pelo método de centrífugo-flutuacão em sacarose, obtendo-se 100% de detecção. A presença de inibidores nas amostras fecais reduziu fortemente a sensibilidade das reações de PCR a partir de DNA extraído pelos métodos avaliados, sendo recomendável o emprego de técnicas de purificação de oocistos previamente à extração de DNA. Os resultados apontam para uma melhor eficiência dos métodos de indução de excistamento e kit QIAmp DNA Stool Mini. === The performance of six methods for DNA extraction from Cryptosporidium spp. oocysts in feces were evaluated by nested PCR of SSU rRNA gene. The methods are the combination with small variations of two techniques for the release of sporozoites (induction of excystation/E or thermal shock/C) and three techniques for DNA purification (phenol-chloroform/F, GuSCN-silica/S or QIAmp DNA Stool Mini kit/K). For the evaluation of analytical sensitivity, tests were made from serial dilutions of purified oocysts, in absence and in presence of 100 μl of cattle feces. The diagnostic sensitivity was assessed by comparison with the microscopic method of centrifugalflotation in sucrose (gold standard) in 15 fecal samples from different naturally infected hosts. In the absence of feces, only methods EF, ES, FC, and CS were tested. EF had the highest analytical sensitivity, enabling the detection of up to 1 oocyst. In the presence of feces, methods EF, EK, and CK showed similar performance, with sensitivity of 104 oocysts. The highest sensitivities were obtained by methods EK and CK, which enabled the detection of 13 (86.7%) of 15 samples. Due to the high analytical sensitivity of EF in purified samples, its diagnostic sensitivity was evaluated in samples of purified oocysts by the method of centrifugal-flotation in sucrose, resulting in 100% detection. The presence of inhibitors in fecal samples greatly reduced the sensitivity of the PCR reactions from DNA extraction methods evaluated, and the use of techniques for purification of oocysts prior to DNA extraction is recommended. The results show a better performance of the methods of induction of excystation and QIAmp DNA Stool Mini kit.