Desenvolvimento de metodologias biotecnológicas para micropropagação, regeneração e transformação genética de teca (Tectona grandis L. f) visando resistência a Hyblaea puera

• Main Author: Evandro Vagner Tambarussi
• Other Authors: Helaine Carrer
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2010
• Subjects: Controle biológico; Cultura de tecidos vegetais; Lagartas; Micropropagação vegetal; Organogênese vegetal; Plantas transgênicas; Reguladores vegetais; Resistência genética vegetal; Teca - Regeneração - Técnicas in vitro.; Biological control of insect; Cefotaxime.; Grow regulators; Organogenesis; Timentin; Tree tissue culture
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11144/tde-16032010-133003/

A transformação genética possibilita a introdução de genes de interesse nos genomas, podendo assim ser empregada na tentativa de melhorar características agronômicas e florestais. No entanto, para a obtenção de plantas transgênicas são necessários protocolos eficientes de regeneração de plantas in vitro. Em teca, dados sobre cultura de tecidos são escassos, havendo a necessidade de determinar condições ótimas para a mesma. Com isso, o trabalho teve por objetivos estudar a organogênese in vitro de teca visando desenvolver um método de regeneração eficiente, avaliar condições para o processo de transformação e testar a susceptibilidade da lagarta Hyblaea puera a toxinas produzidas pelo Bacillus thuringiensis. Foram avaliadas a influência de TDZ e BAP na indução da competência organogenética em hipocótilos, nó cotiledonar e cotilédones de teca. Os biorreguladores AIB, BAP, NAA e GA3 foram utilizados na regeneração de segmentos de hipocótilo, nó cotiledonar, raiz, epicótilo e cotilédone. Antibióticos supressores de Agrobacterium tumefaciens e a higromicina (seleção de células transgênicas), foram também avaliados. Finalmente, testes com o inseticida biológico DipelTM e esporos de B. thuringiensis crescidos em laboratório foram realizados com as lagartas de Hyblaea puera. Na aquisição de competência organogenética o TDZ proporcionou um aumento de 46% na regeneração e o BAP 26% quando comparados ao controle. Para a organogênese in vitro foi avaliado um máximo de 70% de regeneração em nó cotiledonares em meio MS adicionado de 1 mg.L-1 de BAP + 0,5 mg.L-1 de GA3. Entretanto, em outras concentrações dos meios de regeneração hipocótilos, raiz, cotilédones e epicótilos tiveram máximas frequências de regeneração em torno de 60%, 60%, 30% e 10%, respectivamente. Os antibióticos supressores da Agrobacterium tumefaciens tiveram efeitos diferentes para cada explante. Timentin e cefotaxima na concentração de 300 mg.L-1 aumentaram o número de brotos em hipocótilos e nó cotiledonar em 1,6 e 2,0 vezes, respectivamente. Em cotilédone esses antibióticos tiveram efeitos negativos no número de brotos. Carbenicilina em todas as doses influenciou negativamente a regeneração em todos os explantes utilizados. A higromicina a 2,5 mg.L-1 inibe em 100% a regeneração de cotilédones, nó cotiledonar e hipocótilo. Os ínstares mais novos de H. puera são susceptíveis tanto ao produto comercial DipelTM quanto aos esporos crescidos em laboratório, apresentando 100% de mortalidade a concentrações de 2x105 UFC após 24 horas de ingestão. Mostrando assim seu potencial na transgenia visando à expressão de genes de Bt para a resistência a insetos. Os resultados apresentados nesse trabalho contribuem para o ganho de informação sobre os fatores que influenciam a organogênese desta espécie, bem como, definir parâmetros que possam ser utilizados em experimentos futuros visando à transformação genética da espécie. === Genetic transformation allows the introduction of genes in host genomes and can therefore be used to improve forestry and agronomic traits like insect resistence. However, efficient plant regeneration protocols are necessary to obtain transgenic plants. Thus far, information about in vitro teak (Tectona grandis L. f) organogenesis is scarce. Therefore, the aims of this study were: develop an efficient protocol for in vitro organogenesis of teak, assess conditions for its genetic transformation and test the susceptibility of the caterpillar Hyblaea puera to toxins produced by Bacillus thuringiensis. We evaluated the influence of TDZ and BAP on the induction of organogenic competence in hypocotyl, cotyledonary nodes and cotyledons. Growth regulators IBA, BAP, NAA and GA3 were used in the regeneration of the hypocotyl, cotyledonary node, root, epicotyl and cotyledon. Antibiotics for suppression of Agrobacterium tumefacien (timentin, cefotaxime and carbenicillin) and for selection of transgenic cells (hygromycin) were also evaluated. Finally, tests with the biological insecticide DipelTM and spores of B. thuringiensis grown in laboratory were performed with the caterpillar of Hyblaea puera. TDZ increases 46% the regeneration frequency and BAP 26% when compared to controls. Cotyledonary nodes showed the best regeneration frequency (70%) growing on MS medium added of 1 mg.L-1 BAP + 0.5 mg.L-1 GA3. Hypocotyls, roots, cotyledons and epicotyls presented variable frequency of regeneration (60%, 60%, 30%, and 10% respectively) growing on distinct concentrations of grown regulators. We tested three antibiotics (timentin, cefotaxime, and carbenicillin) to suppress A. tumefaciens in vitro growth and they presented different effects on the organogenesis of each explants used in this study. Timentin and cefotaxime at concentration of 300 mg.L-1 increased the number of buds on hypocotyls and cotyledonary nodes. Conversely, these antibiotics had negative effects on the number of shoots of cotyledonary explants. Carbenicillin at all doses presented a negative influence on regeneration of all explants. Hygromycin at concentration of 2.5 mg.L-1 inhibits 100% of regeneration of cotyledons, cotyledonary nodes, and hypocotyls. The young instars of H. puera are susceptible to likely both commercial product DipelTM and spores grown in the laboratory, presented 100% mortality at concentrations of 2x105 CFU after 24 hours of ingestion. These findings suggest its potential to be used in teak transgenic approaches for insect resistance. Our results contribute to information about factors that influence the organogenesis of this specie, as well as define parameters that can be used in future experiments aimed at the genetic transformation of the specie.