Produção de microalgas e caracterização de sua composição protêica e lipídica via espectrometria de massas.

• Main Author: Lidiane Maria de Andrade
• Other Authors: Claudio Augusto Oller do Nascimento
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2014
• Subjects: Composição protêica e lipídica; Espectrometria de massa; Microalgas (Produção); Intact cells; MALDI-TOF; Microalgae
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-11082015-152508/

As mudanças climáticas associadas às atividades humana são devidas principalmente às emissões de CO2 na atmosfera provenientes da queima de combustíveis de origem fóssil. Desta forma, faz-se necessária a substituição dessas fontes fósseis de geração de energia, por fontes renováveis. Dentre as alternativas de fontes renováveis, podemos destacar os biocombustíveis produzidos a partir de microalgas, as quais apresentam composição rica em óleos e proteínas. Um dos grandes desafios encontrados na conversão de biomassa em biocombustíveis é a caracterização detalhada das microalgas. A identificação de espécies através da espectrometria de massas com Ionização/Dessorção à Laser Assistida por Matriz acoplada a analisador por tempo de vôo (MALDI-TOF-MS) utilizada na análise de perfil de proteínas de micro-organismos, e posterior rápida identificação por comparação com os padrões armazenados em bancos de dados (fingerprint) tem se sobressaído. Existem poucos trabalhos na literatura abordando a identificação de espécies de microalgas utilizando a técnica de MALDI-TOF-MS e nenhum trabalho abordando a análise a partir do uso de células de microalgas liofilizadas. Desta forma, nesse trabalho foi estudada a influência de diversos parâmetros tais como placa, modo de análise, valor de PIE, valor de IS2, matriz e solvente de matriz e amostra nos espectros de massas do tipo MALDI-TOF-MS para análise do perfil proteico de células liofilizadas das espécies de microalgas Chlorella vulgaris, Chlorella sp., Desmodesmus sp., Monoraphidium sp. e Oocystis sp. Primeiramente, os cultivos foram realizados em um sistema de agitador orbital otimizado de tal maneira que todas as posições apresentassem as mesmas condições. Após os cultivos, as células foram secas para posterior análise de espectrometria de massas. Para determinação da metodologia que fornecesse os melhores espectros de massas, foram avaliados, aleatoriamente, 3 parâmetros: número de íons (P1), relação sinal/ruído do pico base (P2) e intensidade do pico base (P3). Foi observado que para a maioria das amostras de microalgas, os parâmetros que mais influenciaram na obtenção de espectros de massas do tipo MALDI-TOF bem resolvidos foram a placa, o modo de análise, valor de PIE, valor de IS2 e a matriz. As variações obtidas nos espectros de massas, quando utilizados diferentes solventes tanto para a matriz quanto para a amostra, bem como a adição de isopropanol com o objetivo de melhorar a distribuição da matriz sDHB na placa de amostragem, não foram tão significativas como as observadas para os outros parâmetros avaliados nesse estudo. Como conclusão, o uso da matriz sDHB, solvente TA50 para amostra e matriz, análise na placa polished sob as condições de análise PIE 100ns, IS2 23kV mostraram-se muito mais efetivos para a análise de proteínas a partir de amostras de microalgas liofilizadas. A análise dos lipídios apresentou uma distribuição predominante dos ácidos graxos C16:0, C18:2 e C18:0 para os cultivos de 12 dias e C16:0, C18:2 e C22:6 para os cultivos de 8 dias. Entretanto, as proporções de C22:6 e C18:2 aumentaram para os cultivos de 8 dias. Dessa forma, as espécies de microalgas Chlorella vulgaris., Chlorella sp., Monoraphidium sp. e Oocystis sp. cultivadas por 8 dias podem ser convertidas em biocombustível por apresentarem ácidos graxos entre 14 e 18 carbonos e em sua composição. === Climate change associated to human activities are mainly due to CO&#8322 emissions from combustion of fossil fuels in the atmosphere. Thus, it is necessary to replace these fossil sources of energy generation for renewable sources. Among the alternative of renewable sources, biofuels derived from microalgae is am potential alternative, since microalgae present in their composition fatty acids and proteins. Characterization of microalgae is one of the challenges in the conversion of their biomass into biofuels. The microorganism species identification by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS) thought the analysis of protein profile and subsequent fast identification by comparison with the standard protein profile (fingerprint) in the database has been outstanding. There are few studies in the literature about the identification of microalgae species using MALDI-TOF-MS technique and there is no one using cells of lyophilized microalgae. Thus, in this work was studied the influence of many parameters such as target, analysis mode, PIE, IS2 value, matrix, matrix solvent and sample solvent in the MALDI-TOF mass spectra for analysis of protein profile of lyophilized microalgae cells for the species Chlorella vulgaris cells, Chlorella sp., Desmodesmus sp., Monoraphidium sp. and Oocystis sp. Cultivations were carried out using an optimized shaker system, where all positions presented the same conditions. After the cultivation, the cells were dried for subsequent mass spectrometric analysis. To achieve the best mass spectra profile, 3 parameters were arbitrarily evaluated: number of ions (P1), base peak signal/noise ratio (P2) and base peak intensity (P3). It was observed for most microalgae samples, MALDI-TOF mass spectra profile were most influenced by target, analysis mode, PIE value, IS2 value and the matrix. Variations in the mass spectra obtained when different solvents were used (for matrix and sample) as well as the addition of isopropanol in order to improve the distribution of sDHB matrix on the spot, were not significant as that observed for the other parameters. In conclusion, the use of sDHB matrix, TA50 solvent for sample and matrix, analysis in polished target plate under the following analysis conditions: a PIE 100ns, a IS2 23kV, provided to be more effective for the analysis of protein from lyophilized microalgae cells. Lipid analysis of 12 days cultivated microalgae showed a predominant distribution of the C16:0, C18:2 and C18:0. The 8 days cultivation presented a distribution of C16:0, C18:2 and C22:6, but with C22:6 e C18:2 in a higher proportion. Since biofuel are produced by using the C14-C18 fatty acid contained in their composition, 8 days cultivation showed to be most effective for this purpose.