Desenvolvimento de processo cromatográfico para purificação de fator VIII humano. Emprego de anticorpos contra fragmentos específicos da proteína na avaliação da pureza e estabilidade durante as etapas de purificação.

• Main Author: Daniela Jinzenji
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2008
• Subjects: Biofármacos derivados de plasma; Cromatografia de proteínas; Fator VIII de coagulação; Hemofília; Produção de Fator VIII; Purificação de proteínas de plasma; Biopharmaceuticals Plasma derivation; Chromatography of proteins; Coagulation Factor VIII; Factor VIII production; Hemophilia; Plasma proteins purification
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-10032009-104314/

O fator VIII de coagulação (FVIII), recombinante ou purificado de plasma, é o biofármaco necessário para o tratamento da hemofília A, a doença hemorrágica mais freqüente em humanos. O método tradicional para a purificação de FVIII parte de crioprecipitado de plasma e precipitação alcoólica. No Instituto Butantan, foi proposto um método alternativo, utilizando somente cromatografia para esta purificação. Este projeto teve por objetivo comparar dois métodos cromatográficos de purificação do FVIII: 1 - gel filtração direta do plasma e 2 - pré-purificação de FVIII do plasma por cromatografia de troca aniônica, seguida de gel filtração. A purificação foi analisada por dosagens de atividade específica de FVIII e presença de outras proteínas da cascata de coagulação nas frações de cromatografia. Foram realizadas clonagem de fragmentos gênicos de FVIII e expressão de fragmentos protéicos para imunização de animais. Os soros com anticorpos policlonais anti-FVIII foram usados em ensaios de \"western blot\" para detectar as cadeias de FVIII ou degradação. === Coagulation factor VIII (FVIII), recombinant or purified from plasma, is the biopharmaceutical used for treatment of haemophilia A, the most frequent human hemorrhagic disorder. The traditional method used for purification of FVIII starts from plasma cryoprecipitate and alcoholic precipitation. The Instituto Butantan proposed an alternative methodology using only chromatography for FVIII purification. The main objective of this project was to compare two chromatographic methods for FVIII purification: 1 - direct plasma gel filtration and 2 - pre-purification of FVIII by anion exchange chromatography, followed by gel filtration. The purification process was analyzed by determination of FVIII specific activity and detection of other coagulation factors co eluting in chromatographic fractions. Fragments of FVIII gene were cloned and protein fragments were expressed for animal immunization. Sera with polyclonal antibodies anti-FVIII were used in western blots assays to detect FVIII chains or its degradation.